磷酸甘油酸變位酶5與壞死樣凋亡*

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磷酸甘油酸變位酶5與壞死樣凋亡*

佘浪，彭軍△

(中南大學藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078)

多年來人們認為細胞死亡方式主要包括壞死和凋亡。壞死是不受特定調控的被動死亡方式，表現(xiàn)為細胞器腫脹，細胞膜破裂，內容物滲出，有炎癥反應[1]，而凋亡則是由細胞內胱天蛋白酶(caspase)調控的一種主動死亡方式，因caspase激活導致細胞內底物裂解，破壞胞膜囊泡形成凋亡小體，死亡過程中無內容物滲出，不引起炎癥反應[2]。壞死樣凋亡是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞死亡又一方式，由死亡受體和病原體模式識別受體介導，既有類似凋亡信號的調節(jié)通路，又呈現(xiàn)壞死樣形態(tài)學特征，因此又稱為程序性細胞壞死，在細胞生理和病理功能中發(fā)揮重要作用[3-4]。

磷酸甘油酸變位酶5(phosphoglycerate mutase 5，PGAM5)是磷酸甘油酸變位酶超家族成員之一，是一種糖酵解酶。研究表明，PGAM5能加速發(fā)動蛋白相關蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)去磷酸化，促進線粒體分裂，進而促進壞死樣凋亡，在炎癥反應[5]、神經(jīng)退行性疾病[6]和缺血再灌注損傷[7-8]中發(fā)揮重要作用。由于PGAM5在壞死樣凋亡中扮演重要角色，可能會成為預防和治療損傷相關性疾病的新靶點。

1腫瘤壞死因子誘導的壞死樣凋亡

壞死樣凋亡通路中以腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)誘導的壞死樣凋亡研究最透徹。腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)與其配體結合，可以啟動3種不同的細胞反應：核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)介導的促細胞存活通路及炎癥反應、caspase介導的凋亡途徑、受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)和受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)依賴的壞死樣凋亡。

TNF-α能特異性結合位于細胞表面的TNFR1和TNFR2受體，由于TNFR2不具有死亡結構域，因此主要由TNFR1介導涉及細胞死亡通路的一系列反應[9]。TNFR1激活后，招募RIP1啟動死亡通路，RIP1是決定細胞生存與死亡的交叉點，其結構含有N-末端激酶結構域、中間結構域和C末端死亡結構域。RIP1的泛素化發(fā)生在中間結構域的賴氨酸377位點，其泛素化狀態(tài)是由凋亡蛋白抑制劑(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)維持[10]。RIP1 泛素化決定其促細胞死亡作用。RIP1泛素化后，通過其C末端結構域中的死亡結構域(death domain，DD)促進RIP1招募TNF受體相關死亡結構域(TNF receptor- associated death domain，TRADD)，并與E3泛素連接酶形成復合物Ⅰ[11]，與IκB激酶(IκB kinase，IKK)的調節(jié)亞基NF-κB必須調節(jié)蛋白(NF-κB essential modulator，NEMO)結合，激活NF-κB抑制細胞死亡及免疫反應[12]。若RIP1去泛素化，RIP1在胞質內不與TNFR1結合，通過招募TRADD、caspase-8形成復合物Ⅱ，則激活凋亡信號通路，抑制壞死樣凋亡的發(fā)生[13]。通過RNA干擾抑制去泛素化酶cylindromatosis(CYLD)表達，阻止RIP1去泛素化，則可促進TNF-α誘導的壞死樣凋亡[14]，表明RIP1泛素化是TNF-α誘導壞死樣凋亡的重要一步。壞死樣凋亡一旦啟動，涉及的下游通路和蛋白分子眾多，其中PGAM5參與介導的線粒體裂變對壞死樣凋亡的發(fā)生發(fā)展至關重要。

2磷酸甘油酸變位酶

磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase，PGAM)是一種糖酵解酶，能催化3-磷酸甘油酸(3-phosphoglyceric acid，3-PGA)轉化為2-磷酸甘油酸(2-phosphoglyceric acid，2-PGA)，在碳水化合物轉運、新陳代謝、催化活性及生長發(fā)育扮演重要的作用[15]。人類磷酸甘油酸變位酶超家族至少有10種以上的蛋白編碼基因[16]，根據(jù)編碼蛋白的功能，這些基因可分為3組：第1組包括編碼PGAM的3個基因和二磷酸甘油酸變位酶(bisphosphoglycerate mutase，BPGM)，編碼的蛋白具有磷酸甘油酸變位酶活性或二磷酸甘油酸變位酶活性；第2組包括能編碼6-磷酸果糖激酶2/果糖雙磷酸酶(6-phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase，PFKFB)家族同工酶的4個基因和腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)誘導糖酵解及凋亡調節(jié)因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR)，編碼的蛋白能誘導癌細胞凋亡和糖酵解失調；第3組包括T細胞受體信號抑制蛋白1和2(suppressors of T-cell receptor signaling-1/2，STS-1/2)[17]和編碼PGAM5的3個基因，編碼的蛋白含有泛素相關序列和C末端PGAM結構域，在T細胞受體信號轉導和調節(jié)受體酪氨酸激酶中發(fā)揮重要的作用[16,18]。

3PGAM5

PGAM5雖然屬于磷酸甘油酸變位酶超家族成員，但沒有甘油酸變位酶活性，而是具有磷酸酶活性。PGAM5通過其N端的線粒體導向序列定位在線粒體外膜，因此，PGAM5通常被稱為線粒體磷酸酶[19]。人類PGAM5位于第12號染色體上，通過3'外顯子選擇性剪切產(chǎn)生2種不同的剪切變體，即長型PGAM5-L和短型PGAM5-S(圖1)。2種剪切變體中1～239氨基酸序列相同，不同之處在于PGAM5-L的C末端包含50個氨基酸殘基，而PGAM5-S則包含16個氨基酸殘基，PGAM5-S比PGAM5-L的疏水性強。有趣的是，雖然PGAM5的C末端結構域與磷酸甘油酸變位酶家族其它成員的催化結構域具有同源性，并含有催化活性所必須的組氨酸，但PGAM5并不具有磷酸甘油酸變位酶活性，它主要發(fā)揮磷酸酶活性[18]。

Figure 1.The structure of PGAM5-S and PGAM5-L.Relevant domains for PGAM5-S and PGAM5-L include a conserved multimerization motif WDXNWD (amino acids 58～63), a NxESGE motif that binds Keap1 (amino acids 77～82) and the PGAM domain (beginning at amino acid 98).The difference in the structure between the two isforms locates at the C-terminal starting from amino acid 239.

圖1PGAM5-S和PGAM5-L結構示意圖

近年來發(fā)現(xiàn)PGAM5存在一個高度保守的氨基酸序列WDXNWD，位于N末端的氨基酸58～63位點，對PGAM5參與多聚體復合物的組裝和激活下游通路是必須的，可最大限度地提高磷酸酶的活性[20]。PGAM5-L和PGAM5-S的N末端都含有線粒體定位序列NxESGE，與核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)的DxETGE序列非常相似，都能與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)結合，形成PGAM5/Keap1/Nrf2三元復合物，定位于線粒體外膜[21]。該序列位于PGAM5的77～82氨基酸位點，是PGAM5與DRP1相互作用的基礎，對PGAM5參與線粒體分裂至關重要。此外，PGAM5缺乏磷酸甘油酸變位酶活性，但保留絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性，該特性也是其參與線粒體分裂調節(jié)的生物學基礎[19]。

4PGAM5促線粒體分裂和壞死樣凋亡作用

線粒體是一種高度動態(tài)變化的細胞器，在細胞中不斷分裂與融合，形成緊密連接的線粒體網(wǎng)絡。線粒體的分裂和融合過程除了對于線粒體遺傳和其自身功能的維持很重要外，對于能量代謝、發(fā)育、衰老和細胞死亡等多種細胞功能也十分重要[22]。在哺乳動物中，線粒體融合受線粒體融合蛋白1(mitofusin-1，Mfn-1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin-2，Mfn-2)和 opticatrophy 1(OPA1)等調控，而線粒體分裂主要由DRP1和它相應的配體線粒體分裂蛋白1(fission protein 1，F(xiàn)is1)、線粒體分裂因子(mitochondrial fission factor，Mff)所調控[23]。

研究表明， PGAM5存在于壞死樣凋亡的壞死復合體碎片中，用siRNA沉默PGAM5的2種剪切變體，證實PGAM5-L和PGAM5-S均參與壞死樣凋亡。目前已合成抑制壞死樣凋亡的小分子化合物necrosulfonamide(NSA)，能特異性識別混合系列激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)，阻止壞死樣凋亡信號傳導。有趣的是，NSA能抑制PGAM5-S與RIP1/RIP3的相互作用，而對PGAM5-L與RIP1/RIP3的相互作用無影響。此外，NSA能抑制PGAM5-S磷酸化而對PGAM5-L磷酸化無影響。利用NSA干預和基因沉默等研究手段，科研人員目前已基本闡明PGAM5參與介導壞死樣凋亡的信號通路[24]。

如圖2所示，TNFR介導的壞死樣凋亡啟動后，將形成RIP1/RIP3/MLKL壞死復合體[25-26]。作為RIP3特異性底物蛋白，MLKL是擁有激酶結構域但無激酶功能的假激酶。在壞死復合體形成的起始階段，RIP3絲氨酸227位點發(fā)生磷酸化，并促進MLKL激酶結構域蘇氨酸357位點和絲氨酸358位點雙重磷酸化，MLKL的磷酸化是壞死樣凋亡中不可或缺的一步[27]。雖然MLKL本身不具有激酶活性，但它與RIP3的結合并發(fā)生磷酸化后，成為適配蛋白介導 RIP3與底物蛋白PGAM5結合。PGAM5-L先與RIP1/RIP3/MLKL復合物結合，再激活位于線粒體膜上的PGAM5-S參與，進一步招募線粒體分裂因子DRP1，使DRP1絲氨酸637位點去磷酸化并激活其GTPase活性[24]。DRP1主要分布于胞漿中，是控制線粒體分裂的主要蛋白，一旦被激活，在線粒體外膜招募因子Fis1或Mff的參與下，從胞漿轉移到線粒體外膜特定的分裂位點，形成螺旋樣多聚體結構圍繞在線粒體外膜上，借助于GTP的水解作用，收縮線粒體外膜，直到脂質雙分子層失去其穩(wěn)定性，形成2個線粒體，此時，DRP1已恢復其單體結構回到胞漿中[28]。線粒體分裂導致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增多，膜通透性開放，ATP生成減少，是壞死樣凋亡的早期特征。

Figure 2.The diagram of necroptosis signal pathway initiated by TNF-α. Once TNFR is activated, RIP1, RIP3 and MLKL will interact to form a necrosome after a series of steps.MLKL itself does not have the kinase activity, but can combine with RIP3 to mediate interaction between RIP3 and PGAM5. PGAM5-L combines with RIP1/RIP3/MLKL complex to form a new compound. Once PGAM5-S joins this process, it can recruit DRP1 through dephosphorylation of DRP1 at serine 637, which in turn to promote the mitochondrial fission and necroptosis subsequently.

圖2TNFR介導的細胞壞死樣凋亡通路示意圖

5結語與展望

PGAM5在參與介導促細胞壞死樣凋亡過程中發(fā)揮重要作用，與多種疾病(如心肌梗死、腦卒中)發(fā)展和預后密切相關。目前，PGAM5參與壞死樣凋亡信號通路的環(huán)節(jié)已基本了解，但仍有許多問題，如PGAM5與RIP1/RIP3/MLKL復合物之間的相互作用機制、PGAM5-L與PGAM5-S的關系等，尚待闡明。此外，PGAM5除了參與介導TNFR介導的壞死樣凋亡外，是否還參與其它死亡受體和病原體模式識別受體介導的壞死樣凋亡？闡明和解決上述問題將為開發(fā)針對PGAM5的特異性抑制劑奠定基礎，對于減輕相關疾病癥狀和改善預后具有重要臨床意義。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Phosphoglycerate mutase 5 and necroptosisSHE Lang, PENG Jun

(DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmaceuticScience,CentralSouthUniversity,

Changsha410078,China.E-mail:junpeng@csu.edu.cn)

[ABSTRACT]Necroptosis, or programmed cell death, is a type of cell death with a controllable death signaling pathway and the morphological features similar to necrosis. It is mainly mediated by death receptors or pathogen pattern re-cognition receptors. Among them, tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1)-mediated necroptosis is the most well-studied one. Receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1) and receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) are the 2 key kinases involved in the formation of complex I & II and necrosome in the process of necroptosis. Phosphoglycerate mutase 5 (PGAM5), a member of phosphoglycerate mutase gene family, lacks PGAM activity and possesses the phosphatase activity. PGAM5 is anchored in the mitochondrial membrane and is also called mitochondrial phosphoglycerate mutase 5. It has been shown that PGAM5 involves in the formation of necrosome during necroptosis and it is able to accelerate the fission of mitochondria by dephosphorylation of dynamin-related protein 1 (DRP1), thus promoting cell necroptosis.

[關鍵詞]壞死樣凋亡； 磷酸甘油酸變位酶5； 發(fā)動蛋白相關蛋白1； 線粒體分裂； 磷酸酶

[KEY WORDS]Necroptosis; Phosphoglycerate mutase 5; Dynamin-related protein 1; Mitochondrial fission; Phosphatase

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.031

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0731-82355080; E-mail: junpeng@csu.edu.cn

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.91439104; No. 81373409)

[收稿日期]2015- 09- 29[修回日期] 2015- 10- 23

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0377- 04