核桃分心木提取液抑菌效果初探

閆艷華，王 鵬，楊衛(wèi)民

試驗(yàn)研究

核桃分心木提取液抑菌效果初探

閆艷華，王 鵬，楊衛(wèi)民*

以核桃分心木為試材，研究其甲醇、乙醇和石油醚提取液的抗菌效能，為核桃的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，甲醇提取液和乙醇提取液能清楚的觀察到抑菌圈，石油醚提取液未觀察到抑菌圈；甲醇提取液對大腸桿菌的最低抑菌濃度是3.125%，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度是6.25%，乙醇提取液對大腸桿菌的最低抑菌濃度是6.25%，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度是12.5%。

核桃分心木；分心木提取液；抑菌效果；最低抑菌濃度

核桃(Juglans regia L.)是殼斗目，核桃科，核桃屬的一種落葉喬木[1]。呂梁地區(qū)栽種核桃歷史悠久，目前結(jié)果的核桃樹面積達(dá)5萬hm2，全年總產(chǎn)量為1 740萬kg，分心木的量為2 000 t。根據(jù)呂梁市十二五的規(guī)劃要求，該市在十二五末要實(shí)現(xiàn)種植總量33萬hm2，年總產(chǎn)7 874萬kg，屆時(shí)分心木的量也會達(dá)到10 000 t左右。實(shí)際生活中，核桃分心木大多被丟棄[2]，沒有得到充分的利用，如果能夠充分開發(fā)利用核桃分心木，將會使核桃的價(jià)值進(jìn)一步提升[3-4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料：核桃分心木取自呂梁本地；大腸桿菌E.coli，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，均為呂梁學(xué)院實(shí)驗(yàn)室貯藏菌種；甲醇、乙醇、石油醚均采購于上海。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取液的制備 甲醇提取核桃分心木中的抑菌物質(zhì)：把經(jīng)過風(fēng)干后的核桃分心木搗碎。電子天平稱取50 g樣品倒進(jìn)試劑瓶里，再向瓶中加450 mL甲醇(邊加邊攪拌)，薄膜封口， 25 ℃下放置3 d，注意每天隔一段時(shí)間攪拌1次。3 d后把試劑瓶置于恒溫水浴鍋中回流提取60 min，將所得液體用抽濾泵濾過一次后放到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮。將最后的濃縮液放到60 ℃干燥箱中干燥直至有固體顆粒出現(xiàn)，取出并加入甲醇配置成10 mL溶液，貼上標(biāo)簽，置于0～3 ℃冰箱中，貯藏備用[5-6]。乙醇、石油醚提取核桃分心木中的抑菌物質(zhì)：分別稱取50 g樣品倒進(jìn)試劑瓶里，之后向試劑瓶里加450 mL乙醇和石油醚，方法同上。

1.2.2 供試菌種活化 從冰箱中取出保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌種， 25 ℃下放置24 h后將這兩種供試菌在無菌條件下用接種環(huán)接種到試管培養(yǎng)基里面，每種細(xì)菌重復(fù)接5支；放到37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，選擇一支長勢比較好的菌株作為試驗(yàn)菌種，其余的置0～4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.3 菌懸液的制備 用接種環(huán)挑少許活化菌種放到經(jīng)過滅菌后的9 mL的0.9%的生理鹽水中，搖勻，10倍稀釋法稀釋，然后將稀釋后的每個(gè)菌懸液用移液槍吸取1μL至血球計(jì)數(shù)板上再拿到顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，估算出1 mL的含菌量，反復(fù)操作直至得到含菌量為(6～7)×104個(gè)/mL的菌懸液。

1.2.4 固體平板的制備 牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g，將上述試劑混合倒入蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH到7.3；加熱煮沸使藥品完全溶解， 121 ℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基溫度降到55 ℃左右，在無菌條件下倒入經(jīng)過滅菌且干燥后的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約175～180 mL，最后得到相同規(guī)格的12個(gè)盛有等量培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。

1.2.5 不同濃度各提取液的制備 把上面制成的10 mL各提取液的濃度定為1，然后將其分別連續(xù)稀釋成6種不同濃度；分別是100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的核桃分心木甲醇提取液、乙醇提取液和石油醚提取液[7]。

1.2.6 含抑菌成分濾紙片的制備 將濾紙制成半徑為3 mm的小圓片數(shù)個(gè)，置于玻璃容器內(nèi)，滅菌，風(fēng)干。之后將其分別放到盛有7種濃度(包括對照)的3種不同提取液中浸泡 3 h后貼在燒杯壁上晾干。

1.2.7 抑菌效果的檢測 按無菌操作向各培養(yǎng)皿中等量加入0.6 mL兩種供試菌的菌懸液，用三角涂布器涂布均勻。濾紙片按規(guī)范操作放在不同含菌培養(yǎng)皿中，另取浸泡在甲醇、乙醇及石油醚中的濾紙片做空白對照，分別記作 ck1、ck2、ck3，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放7張濾紙片。置于37 ℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h，檢測是否有抑菌圈出現(xiàn)，如果有抑菌圈就分別量出各抑菌圈的直徑[8]。

1.2.8 最低抑菌濃度(MIC)的測定 MIC值即提取液的最低抑菌濃度，是指在培養(yǎng)基中完全沒有菌能夠存在的各提取液的最低濃度。在該試驗(yàn)中測定各提取液不同濃度的抗菌能力時(shí)采取固體平板，用MIC值來表示各提取液不同濃度的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈法測定抑菌效果

2.1.1 核桃分心木甲醇提取液的抑菌效果 由圖1可知，核桃分心木甲醇提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌這2種供試菌都有抑制作用。較高濃度的提取液表現(xiàn)出較為明顯的抑菌圈，表明抑菌能力較好，低濃度的提取液抑制效果較差，高濃度與低濃度之間的抑菌能力差別不是很明顯，隨著濃度的升高抑制作用差異逐漸增大但變化不太大。對照甲醇的抑菌圈直徑為6 mm，為抑菌濾紙片的直徑，無抑制作用，說明抑菌效果是分心木的作用，而非甲醇的作用。

圖1 不同濃度甲醇提取液抑菌效果

2.1.2 核桃分心木乙醇提取液的抑菌效果 由圖2可知，不同濃度乙醇提取液對各種供試菌都有較好的抑制能力，其中對大腸桿菌的抑制能力比對金黃色葡萄球菌強(qiáng)，并且隨著提取液濃度的降低，提取液對這兩種菌的抑制效果差異逐漸減小。高濃度的提取液能形成明顯的抑菌圈，說明抑菌作用顯著，而低濃度的提取液未發(fā)現(xiàn)清晰的抑菌圈，抑菌作用較差，且高濃度與低濃度的抑菌作用差異顯著。對照乙醇的抑菌圈不明顯，基本沒有抑菌能力，說明抗菌效果來源于分心木。與甲醇提取物相比，此提取物較甲醇提取物抑菌效果要好。

圖2 不同濃度乙醇提取液抑菌效果

2.1.3 核桃分心木石油醚提取液的抑菌效果 石油醚提取液未形成明顯抑菌圈，表明該提取液對這兩供試細(xì)菌都沒有表現(xiàn)出比較好的抑制效果，浸泡在石油醚中的濾紙片在含有供試菌的各培養(yǎng)基上都沒有呈現(xiàn)抑菌圈，該試劑無抑菌作用；和上面兩種提取液相比，此提取液的抗菌效能最差。

2.2 各提取液的最低抑菌濃度(MIC)

由圖3可知，甲醇和乙醇提取液對這兩種菌的最低抑菌濃度不同，而石油醚提取液無抑菌作用。甲醇提取液對大腸桿菌MIC值是3.125%，而對金黃色葡萄球菌MIC值是6.25%;乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的MIC值是12.5%，對大腸桿菌的為6.25%，所以此試驗(yàn)中兩種提取液濃度對大腸桿菌的MIC值最低。兩種提取液無論是在同濃度下還是不同濃度下對大腸桿菌的抑制作用總是比金黃色葡萄球菌顯著。由圖3可知，各提取物中兩種甲醇提取物的抑菌效果最佳，說明甲醇提取抑菌物的效果最好，乙醇次之，石油醚最差。

圖3 各提取液的最低抑菌濃度(MIC)

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)對核桃分心木3種提取液的抑菌作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)核桃分心木的甲醇提取液和乙醇提取液有明顯的抑菌效果，但石油醚提取液未檢測出抑菌能力，另外核桃分心木甲醇提取液的抑菌能力比乙醇提取液有更為顯著的抗菌活性，并且抗菌效能隨著提取液濃度的縮小而逐漸衰減；甲醇提取液濃度在6.25%時(shí)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種細(xì)菌都有抑制能力；而乙醇提取液在12.5%才對兩種細(xì)菌有抑制能力。甲醇提取液對大腸桿菌的MIC值是3.125%，對金黃色葡萄球菌的MIC值是6.25%，乙醇提取液對大腸桿菌的MIC值是6.25%，而對金黃色葡萄球菌的MIC值是12.5%。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載核桃分心木中存在大量的化學(xué)物質(zhì)，其中包括黃酮、生物堿、有機(jī)酸或酚性成分等，比較甲醇提取液、乙醇提取液與石油醚提取液這3種試劑檢測出的成分，黃酮類物質(zhì)和酚性成分能被甲醇、乙醇和石油醚試劑所提取[7，9]，但石油醚卻未能檢測出抑菌效果，這說明石油醚提取出分心木中的抑菌成分的量很少或提取方法不當(dāng)，所以沒有表現(xiàn)出抑制細(xì)菌的作用；而同時(shí)黃酮類等酚性物質(zhì)都能夠抑制細(xì)菌，所以此次試驗(yàn)檢測出的抑菌成分可能是黃酮或酚性物質(zhì)，這有待今后進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。到目前為止，由于缺乏對分心木系統(tǒng)性和綜合性的研究，人們對于核桃分心木的抑菌功效還掌握的比較少，所以我們要提取分心木中的化學(xué)成分做有關(guān)抑菌作用的研究，此次試驗(yàn)是對常見細(xì)菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)的抑制作用的研究，期望將來有關(guān)于抑制常見真菌的研究，以便準(zhǔn)確了解其抑菌效果，并進(jìn)行充分地利用；該試驗(yàn)對于核桃分心木的抗菌效能的研究希望能為核桃分心木的綜合利用及探明其藥用物質(zhì)基礎(chǔ)與食品天然防腐劑領(lǐng)域中的合理開發(fā)利用提供有力的依據(jù)，并能夠開辟出一條新的途徑，最終提高核酸化的綜合開發(fā)利用價(jià)值。

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(山西呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西 離石 033000)

Preliminary studies on Antibacterial Activities of Walnut Diaphragm Extracts

Yan Yanhua, Wang Peng, Yang Weimin

(Department of Life Science, Lvliang University, Shanxi Lishi 033000)

This experiment did research on the antibacterial efficiency of methanol, ethanol and petroleum ether extractive of Semen Juglandis, which provided factual basis for further comprehensive production and development of Semen Juglandis. The result showed that methanol extractive and ethanol extractive can observe the bacteriostatic circle clearly , while petroleum and extractive can not.The minimal inhibitory concentrations (MIC) of methanol and ethanol extractive for E.coli are 3.125% and 6.25%， and Staphylococcus aureus are 6.25% and 12.5% respectively.

Semen Juglandis; extractive;antibacterial activity; minimal inhibitory concentration

2015-11-10

呂梁學(xué)院自然科學(xué)校內(nèi)基金(ZRXN201406)；呂梁學(xué)院自然科學(xué)青年基金(ZRQN201401)

閆艷華(1985-)，女，山西離石人，大學(xué)教師，碩士研究生，主要從事植物生長與發(fā)育研究工作。電話：13835849931，E-mail：19852008@163.com

1005-345X(2016)03-0001-04

S664.1

A

*通訊作者(yangweimin0318@163.com)