脾和腰部淋巴結切除緩解大鼠脛神經損傷后疼痛慢性化

肖霞，杜彬，丁有權，任弘毅，齊建國

（四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院組織胚胎學與神經生物學教研室，成都 610041）

脾和腰部淋巴結切除緩解大鼠脛神經損傷后疼痛慢性化

肖霞，杜彬，丁有權，任弘毅，齊建國*

（四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院組織胚胎學與神經生物學教研室，成都 610041）

目的探討外周淋巴器官在成年大鼠脛神經永久性橫斷傷（即改良型備用性神經損傷，modified spared nerve injury，mSNI）后機械性疼痛異常的慢性轉化中的作用。方法30只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為3組，每組10只動物，分別用于脾臟切除、腰部淋巴結切除和右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除實驗。每項實驗的10只動物再隨機分為外周淋巴器官切除手術組 （n＝5）和假手術組 （n＝5）。所有動物根據實驗分組進行相應的外周淋巴器官切除的手術或者假手術，術后1周進行右側mSNI手術。所有動物于外周淋巴器官切除術前、右側mSNI手術前、mSNI手術后7d和mSNI手術后14d進行von Frey纖維試驗，測試mSNI手術同側和對側大鼠后爪足底面腓腸神經和隱神經皮膚區(qū)域特異性的疼痛反應。結果脾臟和腰部淋巴結切除明顯緩解mSNI后7d和（或）14d的大鼠手術側后爪足底面腓腸神經和隱神經皮膚區(qū)域的機械性疼痛異常。然而，右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除對mSNI后7d和14d的大鼠手術側后爪足底面腓腸神經和隱神經皮膚區(qū)域的機械性疼痛異常沒有顯著影響。結論脾臟和腰部淋巴結參與成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化。

周圍神經損傷；機械性疼痛異常；淋巴結；脾臟；淋巴結切除術；脾臟切除術；von Frey纖維試驗

目前，因周圍神經系統的損害、疾病或功能紊亂引起的周圍性神經病理性慢性疼痛臨床治療困難，嚴重影響患者健康［1-2］。最新的研究表明，成年嚙齒類動物 （大鼠和小鼠）周圍神經損傷后，抗原特異性CD4+T細胞反應參與機械性疼痛異常的慢性轉化［3-4］。對于抗原特異性CD4+T細胞反應而言，浸潤特定組織的T細胞來源于該組織來源的抗原引流到相應的外周淋巴器官，在這些外周淋巴器官中針對該組織來源的特異性抗原的αβTCR+CD4+T細胞大量增殖與活化［5］。然而，參與周圍神經損傷后機械性疼痛異常慢性轉化的外周淋巴器官的具體位置尚不清楚［3-4］。

目前的研究表明，周圍神經損傷后αβTCR+CD4+T細胞大量浸潤受損神經環(huán)路的諸多部位，如損傷神經、去神經支配的皮膚、背根神經節(jié)和脊髓灰質背角［3-4，6-8］。因此，本研究擬手術切除周圍神經損傷后神經環(huán)路中T細胞浸潤的這些部位對應的抗原非特異性和特異性引流外周淋巴器官，利用von Frey纖維試驗評估成年大鼠脛神經永久性橫斷傷（即改良型備用性神經損傷，modified spared nerve injury，mSNI）后的機械性疼痛異常反應，揭示外周淋巴器官在成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常慢性轉化中的作用，為進一步探討周圍神經損傷后機械性疼痛異常慢性轉化的抗原特異性T細胞免疫機制提供基礎。

材料與方法

1 實驗動物和分組

10周齡成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體質量250～300g，購自四川大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（川）2013-026。動物飼養(yǎng)在（22±1）°C的室溫、12h／12h明／暗的光照循環(huán)的空間中，能夠自由獲取水和糧食。所有的動物實驗均嚴格按照四川大學動物保護和倫理委員會的要求和美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物保護和使用指南（出版號85-23，1985修訂版）執(zhí)行。所有動物隨機分為3組，每組10只動物，分別用于組織抗原非特異性引流淋巴器官脾臟的切除、腰段脊髓和背根神經節(jié)抗原特異性引流淋巴器官雙側腰部淋巴結的切除和右側脛神經及其支配皮膚區(qū)域抗原特異性引流淋巴器官右側腘窩淋巴結和腹股溝淋巴結的聯合切除。每項實驗的10只動物再隨機分為外周淋巴器官切除手術組 （n＝5）和假手術組（n＝5）。實驗過程中所有的動物均獨立飼養(yǎng)以便術后護理。

2 動物建模

2.1 外周淋巴器官切除

所有動物根據實驗分組進行相應的外周淋巴器官切除的手術或者假手術。動物按照10ml／kg動物體重的用量經腹腔注射水合氯醛（濃度36g／L）進行麻醉。按照文獻［4］報道進行成年大鼠脾臟切除的手術（圖1A、1B）。經腋前線于腋前線與胸肋骨交點處行皮膚和肌肉縱行切口（約1.5cm長），暴露并分離脾臟，結扎脾蒂，切除脾臟，逐層縫合肌肉和皮膚。按照文獻［9-10］報道進行成年大鼠腰部淋巴結切除的手術（圖2A、2B）。經腹中線行皮膚和腹膜縱行切口，利用牽張器和拉鉤牽張腸管，暴露并切除腹主動脈-髂總動脈分叉處動脈旁的四個腰部淋巴結。復位腸管，逐層縫合肌肉和皮膚。右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除術 （圖3A、3B1、3B2）［10］，則先經股骨第三轉子與腓骨頭連線行皮膚弧形切口，分離股二頭肌前瓣和后瓣，暴露坐骨神經主干和分支至腘窩處，于手術顯微鏡下暴露并切除腘窩淋巴結，同時確保不損傷腘窩處的血管和神經，逐層縫合肌肉和皮膚。然后經腹股溝線中點平行于隱神經投影線行皮膚縱形切口，暴露并切除腹股溝淋巴結，逐層縫合肌肉和皮膚。外周淋巴器官切除假手術僅進行手術組相同的外周淋巴器官暴露和切口縫合操作，不進行外周淋巴器官本身的切除操作。術后大鼠置于37℃熱板上等待蘇醒。術后一周內每兩天進行一次青霉素頸部皮下注射。

2.2 mSNI慢性疼痛模型

外周淋巴器官切除術后1W，按照文獻［11-12］報道進行成年大鼠mSNI的手術。暴露大鼠右側坐骨神經及其脛、腓總和腓腸神經分支，確定脛神經分支并小心游離其周圍的結締組織。在緊鄰坐骨神經分叉處的遠側段處，利用5-0絲線牢固地結扎脛神經，于結扎處遠側利用顯微剪切除5mm長的一段脛神經，同時確保腓總和腓腸神經不受任何損傷。逐層縫合肌肉和皮膚后，將大鼠置于37℃熱板上等待蘇醒。

3 機械性疼痛行為學測試

手術同側大鼠后爪足底面的內側和外側部均進行von Frey纖維試驗，用于分析隱神經和腓腸神經支配區(qū)皮膚的特異性機械性疼痛異常反應。手術對側后爪足底面的對應部位也進行相應的行為學測試。測試時間點為外周淋巴器官切除術前、右側mSNI手術前、mSNI手術后7d和mSNI手術后14d。外周淋巴器官切除術前1W，所有的動物均需要適應試驗環(huán)境，并適應測量疼痛反應基礎值的試驗操作。行為學測試基于單盲法，只由能夠正確執(zhí)行測試的同一人員進行。進行von Frey纖維試驗時，利用觸絲痛覺測試套裝（DanMic Global，美國加州）中的von Frey纖維，按照up-down方法垂直刺激大鼠后爪掌面的內側或外側部，然后按照文獻［13］報道測量和計算50%縮爪閾值。

4 統計學方法

行為學計量資料用SPSS 16.0軟件進行統計描述和推斷。統計數據以均數±標準誤 （mean± SEM）表示。采用重復測量的多因素方差分析和Dunn檢驗分析同一皮膚區(qū)域不同組別動物在不同時間點的疼痛反應的差異，P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 脾切除緩解成年大鼠m SNI后機械性疼痛慢性化

相比于mSNI術前，mSNI術后其手術同側后爪足底面腓腸神經（圖1C）和隱神經（圖1D）皮膚區(qū)域在von Frey纖維試驗中出現縮爪閾值的明顯降低（即機械性疼痛異常）；而mSNI術后其手術對側后爪足底面腓腸神經 （圖1C）和隱神經 （圖1D）皮膚區(qū)域對于輕觸機械刺激的反應沒有明顯的改變。這說明mSNI手術引發(fā)慢性疼痛的有效性和特異性。成年大鼠右側mSNI術前，脾臟切除手術組和假手術組的大鼠其雙側后爪足底面腓腸神經（圖1C）和隱神經（圖1D）皮膚區(qū)域對于輕觸機械刺激的反應在脾臟切除手術前后沒有明顯的變化。這說明脾臟切除本身并不改變未經mSNI手術大鼠的輕觸機械刺激縮爪閾值。相對于脾臟切除假手術組而言，脾臟切除手術組的大鼠在mSNI術后7d和14d其mSNI手術同側后爪足底面腓腸神經（圖1C）和隱神經（圖1D）皮膚區(qū)域的機械性疼痛異常均得到明顯的緩解。這說明組織抗原非特異性引流淋巴器官脾臟參與成年大鼠右側mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化。

圖1 脾切除對成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化的影響。A，脾臟解剖位置示意圖；B，脾臟切除手術示意圖；C，von Frey纖維試驗中大鼠后爪足底腓腸神經皮膚區(qū)域的縮爪閾值；D，von Frey纖維試驗中大鼠后爪足底隱神經皮膚區(qū)域的縮爪閾值。Lsa，左側足底皮膚隱神經分布區(qū)；Lsu，左側足底腓腸神經分布區(qū)；mSNI，改良型備用性神經損傷，即右脛神經永久性橫斷傷；Rsa，右側足底隱神經分布區(qū)；Rsu，右側足底腓腸神經分布區(qū)；sham，脾切除假手術；surgery，脾切除手術。與脾切除假手術或手術前比較：**，P＜0.01；***，P＜0.001；與脾切除假手術比較：＃，0.01＜P＜0.05；＃＃＃，P＜0.001Fig.1 Splenectomy alleviated the chronic transition ofmechanical allodynia aftermSNI in adult rats.A，schematic illustration of the anatomic position of the rat spleen；B，illustration of ratsplenectomy；C，paw withdrawal thresholds of the plantar sural skin area on rathindpaws in von Frey hair test；D，paw withdrawal thresholds of the plantar saphenous skin area on rathindpaws in von Frey hair test.Lsa，left saphenous skin area of hindpaw plantar surface；Lsu，left sural skin area of hindpaw plantar surface；mSNI，modified spared nerve injury（right tibial nerve permanent transection）；Rsa，rightsaphenous skin area of hindpaw plantar surface；Rsu，right sural skin area of hindpaw plantar surface；sham，sham splenectomy；surgery，splenectomy. Compared with before sham splenectomy or splenectomy：**，P＜0.01；***，P＜0.001；compared with sham splenectomy only：＃，0.01＜P＜0.05；＃＃＃，P＜0.001

2 腰部淋巴結切除緩解了成年大鼠m SNI后機械性疼痛異常的慢性轉化

mSNI術前，腰部淋巴結切除手術組和假手術組的大鼠其雙側后爪足底面腓腸神經 （圖2C）和隱神經 （圖2D）皮膚區(qū)域對于輕觸機械刺激的反應在腰部淋巴結切除手術前后沒有明顯的變化。這說明腰部淋巴結切除本身并不改變未經mSNI手術大鼠的輕觸機械刺激縮爪閾值。相對于假手術組而言，腰部淋巴結切除手術組的大鼠，在mSNI術后7d和14d其mSNI手術同側后爪足底面腓腸神經皮膚區(qū)域的機械性疼痛異常均得到明顯的緩解 （圖2C）；且mSNI手術同側后爪足底面隱神經皮膚區(qū)域的機械性疼痛異常在mSNI術后14d也得到明顯的緩解 （圖2D）。這說明腰段脊髓和背根神經節(jié)抗原特異性引流淋巴器官腰部淋巴結參與成年大鼠右側mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化。

圖2 腰部淋巴結切除對成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化的影響。A，腰部淋巴結解剖位置示意圖；B，腰部淋巴結切除手術示意圖；C，von Frey纖維試驗中大鼠后爪足底腓腸神經皮膚區(qū)域的縮爪閾值；D，von Frey纖維試驗中大鼠后爪足底隱神經皮膚區(qū)域的縮爪閾值。sham，腰部淋巴結切除假手術；surgery，腰部淋巴結切除手術。與腰部淋巴結切除假手術或手術前比較：**，P＜0.01；***，P＜0.001；與腰部淋巴結切除假手術比較：＃，0.01＜P＜0.05；＃＃＃，P＜0.001；其他縮寫同圖1Fig.2 Lumbar lymphadenectomy alleviated the chronic transition ofmechanical allodynia aftermSNIin adult rats.A，schematic illustration of the anatomic position of rat lumbar lymph nodes；B，illustration of rat lumbar lymphadenectomy；C，paw withdrawal thresholds of the plantar sural skin area on rat hindpaws in von Frey hair test；D，paw withdrawal thresholds of the plantar saphenous skin area on rat hindpaws in von Frey hair test.sham，sham lumbar lymphadenectomy；surgery，lumbar lymphadenectomy.Compared with before sham lumbar lymphadenectomy or lumbar lymphadenectomy：**，P＜0.01；***，P＜0.001；compared with sham lumbar lymphadenectomy only：＃，0.01＜P＜0.05；＃＃＃，P＜0.001；other abbreviations are the same as noted in Fig.1

3 右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除不影響成年大鼠m SNI后機械性疼痛異常的慢性轉化

mSNI術前，右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除手術組和假手術組的大鼠其雙側后爪足底面腓腸神經（圖3C）和隱神經（圖3D）皮膚區(qū)域對于輕觸機械刺激的反應在淋巴結切除手術前后沒有明顯的變化。這說明淋巴結聯合切除本身并不改變未經mSNI手術大鼠的輕觸機械刺激縮爪閾值。相對于假手術組而言，右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除手術組的大鼠，在mSNI術后7d和14d其mSNI手術同側后爪足底面腓腸神經（圖3C）和隱神經 （圖3D）皮膚區(qū)域的機械性疼痛異常均沒有得到明顯的緩解。這說明右側脛神經及其支配皮膚區(qū)域抗原特異性引流淋巴器官右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結不參與成年大鼠右側mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化。

圖3 右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除對成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常慢性轉化的影響。A，腘窩淋巴結和腹股溝淋巴結解剖位置示意圖；B1和B2，右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除手術示意圖；C，von Frey纖維試驗中大鼠后爪足底腓腸神經皮膚區(qū)域的縮爪閾值；D，von Frey纖維試驗中大鼠后爪足底隱神經皮膚區(qū)域的縮爪閾值。sham，右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除假手術；surgery，右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除手術。與右側腘窩淋巴結-腹股溝淋巴結聯合切除假手術或手術前比較：**，P＜0.01；***，P＜0.001；其他縮寫同圖1Fig.3 Combined excision of right popliteal and inguinal lymph nodes（PLNs and ILNs）did not affect the chronic transition ofmechanical allodynia aftermSNI in adult rats.A，schematic illustration of the anatomic position of rat PLN＆ILN；B1 and B2，illustration of rat combined right PLN-ILN lymphadenectomy；C，paw withdrawal thresholds of the plantar sural skin area on rat hindpaws in von Frey hair test；D，paw withdrawal thresholds of the plantar saphenous skin area on rat hindpaws in von Frey hair test.sham，sham combined right PLN-ILN lymphadenectomy；surgery，combined right PLN-ILN lymphadenectomy.Compared with before sham combined right PLN-ILN lymphadenectomy or combined right PLN-ILN lymphadenectomy：**，P＜0.01；***，P＜0.001；other abbreviations are the same as noted in Fig.1

討 論

本研究通過手術切除周圍神經損傷后神經環(huán)路中T細胞浸潤部位對應的抗原引流外周淋巴器官，結合von Frey纖維試驗評估機械性疼痛異常，首次發(fā)現脾臟和腰部淋巴結參與成年大鼠右側mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化，為進一步探討周圍神經損傷后機械性疼痛異常慢性轉化的抗原特異性T細胞免疫機制和臨床治療提供了依據。

本研究采用成年大鼠mSNI制備周圍性神經病理性疼痛動物模型，以探討外周淋巴器官在成年大鼠周圍神經損傷后機械性疼痛異常慢性轉化中的作用。這種模型是周圍性神經病理性疼痛SNI模型的一種變體，具有手術簡單、病理性疼痛反應強烈而持續(xù)以及疼痛行為容易測試等優(yōu)點［11-12］。由于所有組別的大鼠其mSNI手術對側的機械性疼痛反應在實驗過程中沒有發(fā)生明顯的變化，因此我們觀察到的各實驗組大鼠mSNI手術側疼痛反應的變化不可能是實驗過程中動物自身某些改變引起的。另外，所有外周淋巴器官切除手術本身并不提高未經mSNI手術大鼠的輕觸機械刺激縮爪閾值。這些數據提示，脾臟和腰部淋巴結切除對mSNI術后機械性疼痛異常的緩解是一種特異性反應。雖然本研究沒有長時程 （至少一個月）、密集時間點 （至少每隔一天）地分析外周淋巴器官切除對成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化的影響，但實驗數據仍明確地說明脾臟和腰部淋巴結而非腘窩淋巴結或腹股溝淋巴結參與成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化。另外，本研究沒有研究腦、頸段脊髓和上胸段脊髓的抗原特異性引流淋巴結（即頸部淋巴結）［14-15］和脛神經橫斷近側段的抗原特異性引流淋巴結 （即坐骨淋巴結）［9］在成年大鼠右側mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化中的作用。

本研究的結果有助于探討參與機械性疼痛異常慢性轉化的抗原特異性CD4+T細胞反應在外周淋巴器官和神經環(huán)路的具體位置。由于脾臟非特異性引流和應答所有組織進入血液的血源性抗原，因此我們無法根據脾臟參與成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性化，推斷參與機械性疼痛異常慢性轉化的抗原特異性CD4+T細胞反應在神經環(huán)路的具體位置。然而，本研究卻發(fā)現腰部淋巴結，而非腘窩淋巴結或腹股溝淋巴結，特異性參與成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化。這種淋巴結位置特異性提示，外周淋巴結參與成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化是由于其中的抗原特異性CD4+T細胞反應引起的，而非僅僅提供CD4+T細胞。因此，腰部淋巴結可能是參與成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常慢性轉化的抗原特異性CD4+T細胞反應發(fā)生的特定外周免疫器官。腰部淋巴結特異性引流腰段脊髓以及對應的背根神經節(jié)來源的抗原［9，16-17］，因此腰段脊髓以及對應的背根神經節(jié)可能是參與機械性疼痛異常慢性轉化的抗原特異性CD4+T細胞反應發(fā)生的特定神經環(huán)路位置。而脛神經橫斷遠側段以及后爪足底去神經支配的皮膚 （腘窩和腹股溝淋巴結特異性引流區(qū)域）［6，9，18］中可能的抗原特異性CD4+T細胞反應并不參與成年大鼠mSNI后機械性疼痛異常的慢性轉化。這些結果將有助于深入研究周圍神經損傷后機械性疼痛異常慢性轉化的抗原特異性T細胞免疫學機制。

本研究的結果還有助于探索周圍神經損傷后慢性機械性疼痛異常的靶向性免疫治療。最新的研究表明，基于納米材料的靶向性調控腫瘤特定引流淋巴結中的免疫反應可以抑制腫瘤的轉移［19］。本研究的結果提示周圍神經損傷后，損傷神經對應的脊髓和背根神經節(jié)區(qū)域抗原特異性引流淋巴結，可能是參與機械性疼痛異常慢性轉化的特定外周免疫器官。因此，靶向性調控這些淋巴結中可能的抗原特異性CD4+T細胞反應可能會抑制機械性疼痛異常的慢性轉化。另外，深入研究損傷神經對應的脊髓和背根神經節(jié)以及這些區(qū)域對應的抗原特異性引流淋巴結中機械性疼痛異常特異性抗原有助于揭示其生化性質，為研究周圍神經損傷后慢性機械性疼痛異常的抗原表位特異性的靶向性免疫治療提供依據［20］。

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Splenectomy and lymphadenectomy of lumbar lymph nodes alleviate pain chronification after rat tibial nerve injury

Xiao Xia，Du Bin，Ding Youquan，Ren Hongyi，Qi Jianguo*
（Department of Histology，Embryology and Neurobiology，WestChina School of Preclinicaland Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

ObjectiveTo investigate the role of peripheral lymphoid organs in the chronic transition ofmechanical allodynia in adult rats after permanent transection（modified spared nerve injury，mSNI）of tibial nerves.M ethods30 male adult Sprague-Dawley（SD）rats（ten weeks old，weighing 250-300g）were randomly divided into three groups，10 rats each group for splenectomy，lumbar lymphadenectomy and combined right popliteal and inguinal lymphadenectomy，respectively.Each group were then further divided random ly into two groups，of 5 rats in each，one group for peri-lymphadenectomy，and the other group for sham-operation.The ratswere subjected to surgical excision of different peripheral lymphoid organs according to the design above，and a week after that tomSNIof the right tibial nerves.Von Frey hair testwas employed to evaluate the region-specific pain response on the plantar suraland saphenous skin area of both the ipsilateral and contralateral hindpaws at four different time points：before the excision of peripheral lymphoid organs，beforemSNI，and 7 and 14 days aftermSNI.ResultsSplenectomy and lumbar lymphadenectomy significantly alleviated themechanical allodynia in the sural and saphenous skin area of the ipsilateral hindpaw plantar surface aftermSNI 7 and／or 14 days.while combined right popliteal and inguinal lymphadenectomy had no such effect.ConclusionThe spleen and lumbar lymph nodes are involved in the chronic transition ofmechanical allodynia aftermSNI in adult rats.

Peripheral nerve injury；mechanical allodynia；lymph node；spleen；lymphadenectomy；splenectomy；von Frey hair test

R745

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.06.005

2016-09-08

2016-12-18

國家自然科學基金面上項目（31571240）

肖霞，女（1990年），漢族，碩士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：jgqi＠scu.edu.cn