基于7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光平臺檢測谷胱甘肽

陳 敏， 許慶山， 趙成飛， 陳萍萍， 吳旸婷， 翁少煌， 林新華

基于7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光平臺檢測谷胱甘肽

陳 敏1， 許慶山1， 趙成飛2， 陳萍萍2， 吳旸婷2， 翁少煌2， 林新華2

目的 構(gòu)建7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光平臺檢測谷胱甘肽并用于藥物質(zhì)量控制。 方法 化學法合成MnO2納米薄片并用于吸附7-OH香豆素形成復合體系，由于MnO2納米薄片的內(nèi)濾效應使得7-OH香豆素的熒光猝滅。谷胱甘肽(GSH)可與MnO2發(fā)生氧化還原反應，MnO2轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘腗n2+從而釋放出7-OH香豆素，恢復熒光。對比GSH加入前后熒光的恢復程度，熒光信號增大的幅度與GSH濃度正相關，可實現(xiàn)對GSH的高靈敏檢測。 結(jié)果 該熒光平臺可選擇性識別GSH。在優(yōu)化的實驗條件下，熒光恢復值與GSH在0.03～400 μmol/L呈線性關系，檢測限為0.01 μmol/L。 結(jié)論 構(gòu)建的7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光平臺可簡便、準確地檢測GSH，可用于實際藥品中GSH的測定。

谷胱甘肽； 香豆素類△； 錳化合物； 熒光計； 藥用制劑/*分析； 質(zhì)量控制

還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一種重要的非蛋白類物質(zhì)和抗氧化劑，可以調(diào)整體內(nèi)細胞的正常增殖[1-2]。GSH濃度的變化與癌癥、肝損傷、艾滋病、機體老化、糖尿病等相關；GSH的監(jiān)控也是藥物質(zhì)量控制的重要指標[3-5]。因此，GSH的定性定量檢測對研究機體生理狀態(tài)具有重要的作用。熒光分析法因其靈敏度高、操作簡單、費用低而被廣泛地應用于藥物分子和離子的測定，它可以通過與目標待測分子作用，從而產(chǎn)生因目標誘導的熒光變化，且信號變化值與目標物的濃度呈直接關系[6-7]。香豆素類衍生物含有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，可發(fā)射藍光，具有熒光量子產(chǎn)率高和光穩(wěn)定的優(yōu)點，被廣泛地應用于生物實驗中。二氧化錳(MnO2)納米薄片可吸附熒光量子點材料并猝滅熒光，用于建立信號開關型的熒光檢測體系[8-9]。本研究擬制備MnO2納米薄片，與7-OH香豆素作用形成熒光猝滅的香豆素-MnO2納米復合體系(7-OH香豆素-MnO2復合體系)定量檢測GSH[10]，探索發(fā)展藥物質(zhì)量控制新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光分光光度計(Cary eclipse，美國安捷倫科技有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-2450，日本島津公司)；四甲基氫氧化銨(批號：MKBT8964V)和二氯化錳溶液(MnCl2)(批號：SLBB9634V)，購自美國Sigma-Aldrich公司；GSH(反應級，批號：LN30P109)和7-OH香豆素(批號：L140Q74)購自百靈威科技有限公司；不同pH值的10 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(HAc-NaAc)、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(Na2HPO4-CA)、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(PB)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(NaCA-CA)的原料均從國藥集團化學試劑有限公司購買并于實驗室自制。所有試劑除特別說明外均為分析純，實驗用水為Millipore超純水。

1.2 方法

1.2.1 MnO2納米薄片的制備 稱取2.174 7 g四甲基氫氧化銨和0.593 8 g MnCl2·4H2O，分別溶解于20 mL和10 mL的去離子水中。在20 mL的四甲基氫氧化銨溶液中加入0.6 mL的30% H2O2，并在攪拌的情況下將其全部加入到10 mL的MnCl2溶液中，15 s內(nèi)立即變成黑褐色并產(chǎn)生煙。持續(xù)攪拌過夜反應14 h。后將得到的產(chǎn)物離心(2 000 r/min，20 min)并用去離子水和甲醇分別洗滌3次。洗滌后的產(chǎn)物于60 ℃干燥、備用，得到干燥的MnO2納米薄片約1.52 g。取40 mg MnO2納米薄片溶解于20 mL的去離子水中(2 mg/mL),超聲處理得到分散物。

1.2.2 7-OH香豆素-MnO2復合體系的制備 取30 μL濃度為28 μg/mL的7-OH香豆素溶液，加入 60 μL 2 mg/mL的MnO2溶液，用碳酸氫鈉-檸檬酸緩沖液(10 mmol/L，pH 5.5)稀釋至300 μL，室溫下振蕩反應數(shù)分鐘后得到復合體系。

1.2.3 GSH熒光的檢測 取制備好的7-OH香豆素-MnO2復合體系，加入一定濃度的GSH，在50 ℃下反應 30 min后，轉(zhuǎn)移到350 mL的石英比色皿中，激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，電壓680 V，在激發(fā)波長326 nm處進行熒光測定。

1.2.4 GSH片劑的檢測 稱量10片還原性GSH片，計算平均片重，研細，取100 mg溶解于10 mL水中，過濾后備用。適當稀釋并以1.2.3的實驗條件進行測定，并根據(jù)2015版中國藥典要求計算百分標示含量。

1.2.5 注射用GSH的檢測 將GSH干凍粉(600 mg)加入5 mL去離子水溶解，備用。采用加樣回收率實驗對注射用GSH進行檢測。以1.2.3的相同條件下進行測定，并根據(jù)2015版中國藥典要求計算百分標示含量。

2 結(jié) 果

2.1 7-OH香豆素與 7-OH香豆素-MnO2復合體系的光學表征 紫外可見吸收光譜和熒光激發(fā)、發(fā)射光譜對7-OH香豆素、MnO2納米薄片，7-OH香豆素-MnO2復合體系進行表征(圖1)。7-OH香豆素在325 nm處有一個最大紫外吸收峰，MnO2納米薄片在300～500 nm有一個寬的吸收帶[12]；GSH無明顯的吸收峰；7-OH香豆素-MnO2復合體系在300～500 nm處有2個吸收峰，325 nm處表現(xiàn)出比7-OH香豆素寬并重疊的吸收峰，在375～500 nm處有一個類似MnO2的寬吸收峰；7-OH香豆素-MnO2復合體系中加入GSH后，在325 nm處表現(xiàn)出歸屬于7-OH香豆素吸收峰且相比于7-OH香豆素-MnO2復合體系在325 nm處的吸收值增大，而歸屬于MnO2位于375～500 nm的寬吸收峰有所降低(圖1A)。7-OH香豆素的熒光光譜發(fā)射光譜和激發(fā)光譜可見7-OH香豆素在326 nm處激發(fā)，在458 nm處最大發(fā)射(圖1B)。對比圖1A和1B可知，位于458nm的發(fā)射波長剛好落在MnO2的300～500 nm的寬吸收峰。

2.2 7-OH香豆素-MnO2復合體系檢測GSH的熒光表征 對比不同濃度的GSH加入到7-OH香豆素-MnO2復合體系前后的熒光變化(圖2)。7-OH香豆素中加入MnO2形成7-OH香豆素-MnO2復合體系，7-OH香豆素的熒光明顯降低，熒光猝滅；加入不同濃度的GSH后，原先被猝滅的熒光逐漸恢復，隨著加入GSH濃度的增加而熒光增強，檢測1.0 mmol/L的GSH可以完全恢復7-OH香豆素原先的熒光強度。增強的熒光強度(ΔF)可用于GSH的定量。

2.3 7-OH香豆素-MnO2復合體系檢測GSH的條件優(yōu)化

2.3.1 MnO2濃度優(yōu)化 MnO2納米薄片吸附7-OH香豆素引起熒光猝滅。首先對MnO2的濃度進行優(yōu)化，隨著MnO2濃度的增大，7-OH香豆素的熒光強度逐漸降低。當MnO2濃度為0.4 mg/mL的時候，熒光強度最低(圖3)。

2.3.2 GSH測定體系中緩沖溶液種類及pH優(yōu)化 使用NaH2PO4-CA緩沖液在pH 3～10進行pH篩選，可知在pH 5.5的時候熒光恢復值(ΔF)最強(圖4A)。在此pH條件下，考察不同沖液加入0.5 mmol/L GSH前后的ΔF變化情況，其中 NaH2PO4-CA緩沖液的ΔF變化最大(圖4B)。選擇pH 5.5的NaH2PO4-CA緩沖液為最佳的溶液反應體系。

2.3.3 GSH測定體系中溫度及反應時間優(yōu)化 對比30 min時不同溫度的ΔF，在50 ℃的時候最大(圖5A)?？疾?0 ℃的條件下檢測GSH時的動力學反應過程，在25 min時反應達到平衡，且后續(xù)熒光值保持穩(wěn)定(圖5B)，故50 ℃下反應25 min為最適的反應溫度和時間。

2.4 GSH檢測的特異性 常見的金屬離子不會對7-OH香豆素的熒光響應產(chǎn)生顯著影響(圖6A)。在相同的測定條件下，除了半胱氨酸(Cys)含有與GSH一樣的巰基基團，可以恢復熒光，其他的生物分子(多巴胺、抗壞血酸和多種氨基酸)不會恢復7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光(圖6B)。

2.5 GSH的定量檢測

2.5.1 GSH標準曲線的繪制 用7-OH香豆素-MnO2復合體系在最佳的反應條件下測定一系列不同濃度的GSG標準溶液，探討GSH濃度與7-OH香豆素的熒光強度恢復值(ΔF)的關系。隨著GSH濃度增加，其熒光強度逐漸加強(圖7A)。當GSH在0.03～400 μmol/L內(nèi)，其濃度與ΔF呈正相關(圖7B)，其線性方程為ΔF=1.769 4CGSH+18.797 5，R2=0.990 4，檢測限為0.01 μmol/L(S/N=3)。

2.5.2 還原型GSH片劑和凍干粉中GSH的含量測定 以還原型GSH片劑和凍干粉作為代表性實際樣品，加入特定稀釋倍數(shù)的片劑或者凍干粉，測定其熒光強度，以標準曲線(△F=1.769 4CGSH+18.797 5)測定濃度，并根據(jù)藥典要求，計算得到片劑和凍干粉的百分標示含量分別為102.7%和97.7%，符合藥典規(guī)定的百分標示含量(95.0%～105.0%)。

3 討 論

紫外可見吸收光譜和熒光光譜可用于熒光染料(材料)的光學性質(zhì)及其變化的測定。由于7-OH香豆素的π-π*躍遷，其最大紫外可見吸收峰位于325 nm。7-OH香豆素-MnO2復合體系在紫外可見吸收光譜中325 nm位置的吸收峰和375～500 nm范圍的寬吸收峰表明所制備的7-OH香豆素-MnO2復合體系包含了7-OH香豆素和MnO2的各自性質(zhì)，且其中位于375～500 nm范圍的寬吸收峰是由于MnO2八面體結(jié)構(gòu)的d-d躍遷引起的[11]。7-OH香豆素最大發(fā)射波長位于458 nm的熒光發(fā)光光譜剛好位于MnO2的寬吸收峰范圍，可以發(fā)生內(nèi)濾效應，從而使得7-OH香豆素-MnO2復合體系中香豆素的熒光發(fā)光光譜被MnO2所吸收而猝滅熒光[11]。

7-OH香豆素-MnO2復合體系猝滅的熒光隨著GSH的加入而逐漸恢復，這是由于GSH具有還原性，與MnO2納米薄片反應并將MnO2還原成可溶性的Mn2+，釋放出原先吸附在MnO2納米薄片表面的7-OH香豆素，從而恢復熒光。隨著加入GSH濃度的增加，熒光恢復程度(ΔF)增強。因此，選擇GSH加入前后熒光恢復程度(ΔF)定量檢測GSH的濃度。

MnO2納米薄片通過吸附7-OH香豆素而形成熒光猝滅體系，其濃度會影響7-OH香豆素的猝滅效率。隨著MnO2濃度的增大，7-OH香豆素的熒光強度逐漸降低，因此選用適量的MnO2納米薄片可有效吸附7-OH香豆素以形成檢測GSH的熒光平臺。合適的緩沖液類型及pH有利于MnO2與GSH氧化還原反應的進行以提高GSH的檢測性能。溫度的升高有利于反應的進行從而提高熒光恢復值，但溫度過高會加劇熒光分子間的碰撞而降低熒光恢復值。MnO2與GSH反應需要一定的時間，熒光恢復值隨時間延長先增大后趨于穩(wěn)定，反應完成，從而完全釋放7-OH香豆素。

生物體系、藥物中成分復雜繁多。通常情況下，金屬離子如Fe3+，Cu2+等會對熒光染料或材料產(chǎn)生猝滅作用[6,12]，因此首先對比多種金屬離子對7-OH香豆素熒光響應的影響。本研究結(jié)果顯示，較高濃度的金屬離子不會影響7-OH香豆素的熒光響應。在相同實驗條件下，除了Cys因含有與GSH一樣的巰基(-SH)將MnO2納米薄片還原成Mn2+，可以使7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光恢復，而其他的生物分子不會恢復7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光。由于常見的藥物中幾乎不添加Cys，因此，應用7-OH香豆素-MnO2復合體系可以選擇性地檢測藥物中GSH。

在優(yōu)化的條件下，應用7-OH香豆素-MnO2復合體系測定不同濃度的GSH。隨著GSH濃度的增大，7-OH香豆素的熒光逐漸恢復增強，△F逐漸增大。GSH在0.03～400 μmol/L范圍內(nèi)，△F與GSH濃度呈線性關系，其線性方程可用于實際體系中GSH含量的定量分析。根據(jù)信號/背景值為3(S/N=3)的關系得到本方法測定GSH的檢測限(0.01 μmol/L)較低，可以滿足生物體系、藥物分析等方面檢測的要求。還原型GSH片劑和凍干粉測定的百分標示含量符合2015版中國藥典的要求，說明本方法測定實際藥物的準確度。

綜上所述，本研究發(fā)展并建立基于7-OH香豆素-MnO2復合體系的熒光信號平臺，建立了簡便、快速、準確的GSH測定新方法，可進一步發(fā)展此技術(shù)用于實際藥品生產(chǎn)、流通、經(jīng)營、管理過程中GSH的測定。

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(編輯:張慧茹)

Fluorescent Platform Based on 7-Hydroxycoumarin-MnO2Composites for Glutathione Sensing

CHEN Min1, XU Qingshan1, ZHAO Chengfei2, CHEN Pingping2,WU Yangting2, WENG Shaohuang2, LIN Xinhua2

1. Department of Orthopedic Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China；2. Department of Pharmaceutical Analysis, Faculty of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

Objective To construct a fluorescence platform based on 7-Hydroxycoumarin-MnO2composites for the detection of glutathione and for its application in drug quality control. Method MnO2nanosheets prepared by chemical method were used for the adsorption of 7-OH to form a composite system. Due to the internal filtering effect of MnO2nanosheets, the fluorescence of 7-Hydroxycoumarin was quenched. The introduction of glutathione (GSH) reacted with MnO2through redox reaction, and MnO2was transformed into soluble Mn2+to release absorbed 7-Hydroxycoumarin therefore recovered the quenched fluorescence. Compared the change in fluorescence intensity before and after the addition of GSH, the magnitude of the increase in fluorescence signal was positively correlated with the GSH concentration, therefore the high sensitive detection of GSH could be realized. Result The fluorescence platform can selectively recognize GSH. Under the optimized experimental conditions, the fluorescence recovery value was correlated with the GSH in the range of 0.03 μmol/L to 400 μmol/L in a linear relationship, and the detection limit was 0.01 μmol/L. Conclusion The construction of 7-Hydroxycoumarin-MnO2composites can be used to detect GSH easily and accurately in medicinal testing.

glutathione； coumarins△； manganese compounds； fluorometry； pharmaceutical preparations/*analysis； quality control

2016-06-23

國家自然科學基金(21405016)；福建省自然科學基金(2015J01475,2015J01043)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2013-ZQN-JC-16)

福建醫(yī)科大學 1.附屬協(xié)和醫(yī)院 骨科，福州 350001； 2.藥學院 藥物分析學系，福州 350108

陳 敏(1976-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士

翁少煌. Email: shweng@fjmu.edu.cn

R341.6

A

1672-4194(2016)06-0349-05