3種不同染色方法對抗酸染色的影響

李國平， 王鵬程， 張 聲

3種不同染色方法對抗酸染色的影響

李國平， 王鵬程， 張 聲

目的 評價3種不同染色方法對檢出抗酸桿菌的影響。 方法 收集2012-2015年存檔的結(jié)核和麻風(fēng)病例60例，分別采用不同的染色方法進(jìn)行抗酸染色：第1種方法為傳統(tǒng)的Ziehl-Neelsen染色法；第2種方法是將脫蠟液由二甲苯改為松節(jié)油和汽油的混合液，且染色后不脫水，不透明，直接烘干、蓋片；第3種方法是在第2種方法的基礎(chǔ)上使用了添加表面活性劑Triton-100的染液。比較3種不同染色方法的染色效果及抗酸桿菌的檢出率。 結(jié)果 3種方法的檢出率分別為第1種方法20%、第2種方法31.7%、第3種方法41.7%，其中第3種方法與另外2種方法比較差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P1vs3<0.001，P2vs3=0.031)。 結(jié)論 添加表面活性劑Triton-100的染液，染色效果及抗酸桿菌的檢出率明顯升高，具有較高臨床應(yīng)用價值。

染色與標(biāo)記； 表面活性劑； L型菌

對于抗酸桿菌，因為菌體壁上含有一定量的脂質(zhì)，故抗酸染色一般不易著色，但是這類細(xì)菌一經(jīng)染上顏色，又不易褪色，即使用酸類物質(zhì)處理也不易脫色，故該類細(xì)菌又稱為抗酸桿菌[1]。常見的抗酸桿菌為結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌及非典型分枝桿菌。在常規(guī)病理診斷中多采用傳統(tǒng)的Ziehl-Neelsen染色法，但是檢出率偏低。筆者科室經(jīng)實踐摸索出提高抗酸桿菌的檢出率的方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集2012-2015年經(jīng)臨床及病理確診的結(jié)核或麻風(fēng)患者60例，男性42例，女性18例，年齡(52.43±9.81)歲(26～71歲)。60例組織均用4%中性甲醛固定(pH 7.2)，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。

1.1.2 試劑 堿性復(fù)紅飽和液：10 g的堿性復(fù)紅溶于無水乙醇100 mL，過濾后備用；5%石碳酸水溶液：50 mL石碳酸+950 mL蒸餾水；汽油松節(jié)油液：航空汽油50 mL+松節(jié)油50 mL；10% Triton-100溶液；蘇木精溶液：蒸餾水750 mL，硫酸鋁鉀17.5 g，蘇木精2.0 g，碘酸鈉0.2 g，冰乙酸8 mL；二甲苯；各梯度濃度的酒精；中性封片劑；1%鹽酸酒精：1 mL HCl+99 mL 70%乙醇；石碳酸復(fù)紅溶液：堿性復(fù)紅5 mL+5%石碳酸水溶液45 mL；5% Triton-100石碳酸復(fù)紅溶液：5%石碳酸水溶液42.5 mL，堿性復(fù)紅5 mL，10%Triton-100溶液2.5 mL。

1.2 方法 (1)第1種方法為傳統(tǒng)的Ziehl-Neelsen染色法。切片二甲苯脫蠟至蒸餾水。將切片置于石碳酸堿性復(fù)紅溶液30 min，用吸水紙將切片正反面染液吸干，用1%鹽酸酒精適度分化。流水沖洗5 min，蘇木精淺染(1 min)，流水返藍(lán)。常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。(2)第2種方法是將脫蠟液由二甲苯改為松節(jié)油和汽油的混合液。切片用汽油松節(jié)油脫蠟2次[2]，每次10～15 min。不用酒精洗，切片用吸水紙吸干。流水沖洗10 min，過蒸餾水1 min，浸入碳酸堿性復(fù)紅溶液30 min，用吸水紙將切片正反面染液吸干，用1%鹽酸酒精適度分化。流水沖洗5 min，蘇木精染1 min，流水返藍(lán)，烘干(不宜用乙醇脫水)，中性樹脂封固。(3)第3種方法是在第2種方法的基礎(chǔ)上使用了添加表面活性劑Triton-100的染液。切片用汽油和松節(jié)油的混合液脫蠟2次，每次10～12 min。不用酒精洗，切片用吸水紙吸干，流水沖洗10 min，過蒸餾水1 min。浸入10% Triton-100石碳酸復(fù)紅溶液30 min，用吸水紙將切片正反面染液吸干，用1%鹽酸酒精適度分化至切片染成粉色，水洗，流水沖洗5 min，蘇木精染1 min，流水返藍(lán)，烘干，中性樹脂封固。

1.3 結(jié)果判讀 結(jié)果均由雙人進(jìn)行鏡檢，抗酸桿菌陽性菌體染色后呈鮮紅色，背景著色為淡藍(lán)色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)，兩兩比較采用McNemar檢驗。P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

陽性結(jié)果：結(jié)核桿菌鏡下形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)長微彎曲的桿狀菌，長短不一，兩端鈍圓；麻風(fēng)桿菌常在泡沫細(xì)胞(麻風(fēng)細(xì)胞)內(nèi)聚集成堆，鏡下表現(xiàn)較粗短?？顾釛U菌陽性菌體染色后呈鮮紅色，胞核呈藍(lán)色，背景著色為淡藍(lán)色，對比清晰，無其他著色。陰性結(jié)果：未找到紅色桿菌，整張片子只有淡藍(lán)色背景。3種方法抗酸染色的陽性檢出率兩兩比較，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P1vs2=0.016，P1vs3<0.001，P2vs3=0.031，表1)，其中第3種方法的檢出率明顯高于其他2種方法。3種方法的染色效果見圖1。經(jīng)第3種方法染色后，菌體更清晰，呈亮紅色，無折光，使得細(xì)菌的顏色與背景對比明顯，更易檢出，對于缺乏經(jīng)驗者可能更容易檢出抗酸桿菌。

表1 3種抗酸染色方法在60例病例中的陽性檢出率

Tab 1 The positive rates of acid-fast staining in 60 cases by three methods respectively

與第1種方法比較，☆：P<0.05；與第2種方法比較，△：P<0.05.

3 討 論

抗酸染色作為診斷結(jié)核和麻風(fēng)的一種重要特殊染色，是由抗酸桿菌的分子結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)決定的?？顾釛U菌的表面因有一層類脂或脂質(zhì)夾膜而不易著色，一旦著色，酸性酒精的作用不易將其脫色，故顯紅色的為抗酸桿菌，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色。筆者于臨床工作中對抗酸染色進(jìn)行細(xì)節(jié)上的改良，從而提高抗酸桿菌的檢出率，可更好地服務(wù)于臨床。

抗酸染色在診斷結(jié)核病時也存在局限性。包括：抗酸桿菌的形態(tài)、大小不一，識別時存在差異；抗酸桿菌的識別需要油鏡觀察，對于手術(shù)切除的大組織塊難以觀察到全部組織，且抗酸桿菌在組織中分布不均勻[3]，客觀上存在一定的漏診率。如臨床高度疑為結(jié)核病，而抗酸染色鏡下形態(tài)學(xué)不典型，則需要選擇多塊蠟塊行抗酸染色[4]，以提高診斷率。因此，在臨床病理實踐中，摸索出可以改善抗酸染色效果及提高抗酸桿菌檢出率的方法就顯得尤為重要[5-6]。主要表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)脫蠟液的選擇。人抗酸桿菌菌體含有脂質(zhì)，易溶于酒精，為保護(hù)菌體的脂質(zhì)不受破壞并保持菌體的完整性，故采用汽油和松節(jié)油的等量溶液做為脫蠟液進(jìn)行脫蠟[7]，有效地避免了菌體的破壞，從而提高檢出率，但要經(jīng)常更換，否則會出現(xiàn)組織脫蠟不凈或染料沉淀，造成整片紅色污染，即使用硫酸也無法脫色，染色結(jié)果不易判斷。(2)切片厚度的選擇。為提高切片內(nèi)抗酸桿菌的含量，應(yīng)適當(dāng)增加切片厚度，一般為5～6 μm，并建議使用防脫蠟玻片，在65 ℃烤箱內(nèi)延長烤片至2 h，防止掉片。(3)酒精對染色的影響。為避免染色后脫水用的不同濃度的酒精對脂質(zhì)的破壞，切片染色烘干后直接蓋片進(jìn)行觀察，染色后的切片不進(jìn)行脫水透明。(4)表面活性劑的應(yīng)用。由于抗酸桿菌的菌體含有一層蠟質(zhì)，使得染液難以進(jìn)入，致使染色效果不佳。有文獻(xiàn)報道，加入表面活性劑可明顯增加切片中分枝桿菌的被染色率[8-10]。Triton-100是具有與極性分子和非極性分子相結(jié)合的親水基團(tuán)和親油基團(tuán)的表面活性劑，通過降低物質(zhì)表面張力使細(xì)胞通透性增加，提高染液的滲透力，使染色均勻，起助染劑的作用，明顯改善染色效果，提高檢出率。(5)分化液的把握。鹽酸酒精分化要適度，分化不足則染色背景較深，抗酸桿菌顯示不明顯；分化過度，使得一些抗酸桿菌因量較少或染色較弱，顯示不出來。較好的分化應(yīng)在切片經(jīng)水洗后顯示為淡淡的紅色為宜。(6)染色時間的控制。為了便于觀察，應(yīng)嚴(yán)格控制復(fù)染的時間，肉眼觀察呈淺藍(lán)色即可，不宜過長。過度復(fù)染可能掩蓋陽性著色，造成假陰性，降低陽性率，要做到“寧淡勿深”。(7)觀察結(jié)果時的注意事項。由于在組織處理過程中，二甲苯及酒精對菌體的破壞，且大部分標(biāo)本為非穿刺標(biāo)本，抗酸桿菌含量較少，陽性率低，所以除染色因素會對觀察結(jié)果造成影響外，閱片人員的判斷能力也至關(guān)重要。正確辨認(rèn)抗酸染色陽性桿菌是做出正確診斷的基礎(chǔ)，應(yīng)在壞死的周圍組織尋找抗酸桿菌，并用油鏡進(jìn)行觀察，提高檢出率。對于臨床上高度懷疑抗酸桿菌感染的標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行全視野觀察，克服視覺疲勞，多次反復(fù)閱片，防止因漏看而造成假陰性。建議進(jìn)行雙人觀察染色結(jié)果，避免因個人的主觀性造成漏診或誤診，提高檢出率。

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(編輯：何佳鳳)

The Effects of Three Different Staining Methods on Acid-fast Staining

LI Guoping, WANG Pengcheng, ZHANG Sheng

Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Objective To evaluate the effects of three different stainingmethods on the detection of acid-fast bacilli. Methods We reviewed 60 cases of tuberculosis and leprosy archived from 2012 to 2015 in the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Three different staining methods were used for acid-fast staining. Method One: the traditional Ziehl-Neelsen staining method. Method Two: Instead of the original dewaxing liquid xylene,mixture of turpentine oil and gasoline was used andthe specimen underwent directly drying and glass covering after dying without dehydration and transparency. Method Three: In addition to what were in the Method Two, surfactant Triton-100 was used. The dyeing effects of the three different staining methods and the detection rates of acid-fast bacilli were compared accordingly. Results The detection rates with Method One, Method Two, and Method Three were 20%, 31.7% and 41.7% respectively. The differences shown in the pairwise comparisons with the three methods were statisticallysignificant (P1vs3<0.001,P2vs3=0.031). Conclusion The group with the addition of surfactant triton-100 dye produced a higher dyeing effect and detection rate of acid-fast bacilli than those of the other two groups. The third staining method tested provides higher value on clinical application.

staining and labeling; surface-active agents; L forms

2016-08-15

福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(2014-1-62)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院病理科，福州 350005

李國平(1979-)，男，主管技師

張 聲. Email: zhgshg@126.com

R378； R446； R446.8

A

1672-4194(2016)06-0420-03