青蒿琥酯對顎部小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系增殖侵襲能力及SP1蛋白表達(dá)的影響

陳宇麟，陳　虎，李佳荃，農(nóng)曉琳

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科；2.醫(yī)學(xué)科學(xué)試驗(yàn)中心，廣西 南寧　530021)

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青蒿琥酯對顎部小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系增殖侵襲能力及SP1蛋白表達(dá)的影響

陳宇麟1，陳虎1，李佳荃2，農(nóng)曉琳1

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科；2.醫(yī)學(xué)科學(xué)試驗(yàn)中心，廣西 南寧530021)

摘要：目的探索青蒿琥酯(ART)對人顎部小涎腺腺樣囊性癌(NACC)細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。方法用MTT法檢測經(jīng)37.5、150、600 μmol·L-1ART干預(yù)24、48 h后，NACC細(xì)胞體外增殖水平的變化；Transwell法檢測37.5、150、600 μmol·L-1ART干預(yù)48 h后，NACC細(xì)胞體外侵襲能力的變化；Western Blot法檢測ART干預(yù)48 h后，NACC細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子SP1蛋白表達(dá)水平的變化;各實(shí)驗(yàn)方法均設(shè)立空白對照組及5 μmol·L-1順鉑(DDP)陽性對照組。結(jié)果與對照組比較，ART作用于NACC細(xì)胞24 h時(shí)即表現(xiàn)出對其增殖能力的抑制作用(F=12.071，P<0.001)，作用時(shí)間延長至48 h時(shí)，抑制作用更加明顯(F=169.098，P<0.001)；Transwell實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，37.5、150、600 μmol·L-1ART組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少(F=139.939，P<0.001)；Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對照組相比，37.5、150、600 μmol·L-1ART及5 μmol·L-1DDP陽性對照組中SP1蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度的下降(F=200.998，P<0.001)。結(jié)論青蒿琥酯可以有效抑制NACC細(xì)胞體外增殖及侵襲能力，并下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子SP1表達(dá)，二者間可能存在聯(lián)系。

關(guān)鍵詞：青蒿琥酯；腺樣囊性癌；增殖；侵襲；轉(zhuǎn)錄因子；SP1

Influence of Artesunate on proliferation, invasion ability and the

expression levels of SP1 protein of novel human palatal salivary

gland cell line of adenoid cystic carcinoma

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是一種好發(fā)于涎腺的惡性腫瘤，具有生長相對緩慢，有嗜神經(jīng)侵襲、易沿血管侵襲擴(kuò)散的特性，在癌變的早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移。單純通過手術(shù)治療難以徹底切除癌變組織，治療后很容易復(fù)發(fā)，且伴有極高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，長期預(yù)后效果不佳?；熓桥R床治療ACC的重要組成部分，特別是針對發(fā)生轉(zhuǎn)移之后，化療更是成為了主要的治療手段。青蒿素是從黃花蒿中分離出來的化合物[1]，是一種高效、低毒的抗瘧藥[2]，近年來的研究表明[3-4]，青蒿素及其衍生物不僅在治療瘧疾方面卓有成效，在抑制腫瘤的方面也表現(xiàn)出了值得關(guān)注的潛力。本課題組前期使用青蒿琥酯(ART)對人源顎部小涎腺腺樣囊性癌NACC細(xì)胞系進(jìn)行了體外干預(yù)，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯在體外可以促使NACC細(xì)胞凋亡、抑制其遷移能力[5-6]。為進(jìn)一步探明青蒿琥酯對腺樣囊性癌的作用，本實(shí)驗(yàn)研究擬從該藥抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力。和對轉(zhuǎn)錄因子SP1的影響方面入手，做進(jìn)一步探索。

1材料

1.1細(xì)胞株腺樣囊腺癌細(xì)胞株NACC由課題組前期原代培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代獲得[7]。

1.2試劑與藥物RMPI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(杭州四季清公司)；四甲基氮唑鹽MTT(美國SIGMA)；二甲基亞砜DMSO(北京Solarbio)；SP1一抗?jié)饪s型，熒光二抗(英國Abcam)；Matrigel基質(zhì)膠( 美國BD 公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國Corning,底面積為25 cm2);96孔板，Transwell小室(美國Costar，膜孔徑為8 μm)；順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；注射用青蒿琥酯(廣西桂林南藥股份有限公司)。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)；酶標(biāo)儀(美國BIO)；CKX41 型倒置相差顯微鏡(Olympus) NanoDrop200-型Thermo紫外分光光度計(jì) (Thermo)；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)；電泳儀(美國BIO-RAD)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

2方法

2.1細(xì)胞的培養(yǎng)腺樣囊腺癌細(xì)胞株NACC生長于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的RMPI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長接近80%匯合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2四甲基氮唑鹽(MTT)法檢測青蒿琥酯對NACC細(xì)胞增殖的抑制作用收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞, 以0.25%胰酶消化, 計(jì)數(shù), 接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi), 使每孔細(xì)胞密度為5 000個(gè),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h，換含有37.5、150、600 μmol·L-1ART和5 μmol·L-1DDP的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)20 、44 h，以不含藥物的無血清培養(yǎng)基為空白對照。每孔加20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液。接著每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測青蒿琥酯對NACC細(xì)胞侵襲能力的抑制作用在Boyden小室下室加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子, 上下室之間由聚碳酸酯微孔濾膜隔開(直徑13 mm 、孔徑8 μm), 膜上均勻鋪每孔60 μL/的人工基底膜膠(Matrigel , BD 公司),37℃溫箱聚合30 min。將NACC細(xì)胞按照1×105個(gè)每孔，接種于六孔板中，待NACC細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)用含37.5、150、600 μmol·L-1ART和5 μmol·L-1DDP的完全培養(yǎng)基干預(yù)48 h，以不含藥物的完全培養(yǎng)基作為空白對照，干預(yù)完成后用0.25%的胰酶消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并重懸，每組取細(xì)胞懸液400 μL(2 ×104個(gè)細(xì)胞)加入上室,于37℃, 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。吸棄上室液體，擦去小室膜內(nèi)表面未侵襲的細(xì)胞及Matrigel膠,每個(gè)小室加入200 μL PBS液漂洗，棄去PBS后，用4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色。每組設(shè)3個(gè)平行樣本，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)400倍顯微視野下的穿膜細(xì)胞數(shù), 計(jì)算平均值, 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4蛋白印跡法檢測青蒿琥酯對SP1蛋白表達(dá)的影響分別收集用上述藥物干預(yù)后的細(xì)胞，用蛋白裂解液處理之后離心取上清，加入蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸15 min，分別取各組蛋白400 μg于10%SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h，覆上SP1兔單抗(1∶1 000)過夜，TBST洗滌5次，每次5 min。加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min(注意避光操作)，掃描PVDF膜進(jìn)行圖像分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3結(jié)果

3.1青蒿琥酯對NACC細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果顯示：青蒿琥酯作用24 h，對NACC細(xì)胞具有一定的抑制作用，各實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組與空白組比較，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組間比較未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。青蒿琥酯作用48 h，各實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組與空白對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組組間比較，除600 μmol·L-1ART組外其余各實(shí)驗(yàn)組同陽性對照組比較，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=169.098，P<0.001(表1)。

±s,n=3)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與陽性對照組比較，ΔΔΔP<0.001。

3.2青蒿琥酯對NACC細(xì)胞侵襲能力的抑制作用

400倍鏡下每個(gè)副孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)并求取平均值，空白對照組(103±15.4)個(gè)、37.5 μmol·L-1ART組(52±6.8)個(gè)、150 μmol·L-1ART組(22±2.9)個(gè)、600 μmol·L-1ART組(7.6±2.2)個(gè)、陽性對照組(5±1.6)個(gè)，結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)與空白對照組比較差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，37.5 μmol·L-1ART組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)與600 μmol·L-1ART組及陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，150 μmol·L-1ART組、600 μmol·L-1ART組及陽性對照組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=139.939，P<0.001(圖1A、1B)?？瞻讓φ战M37.5 μmol·L-1ART150 μmol·L-1ART

600 μmol·L-1ART陽性對照組

圖1A不同濃度ART干預(yù)NACC細(xì)胞 圖1B不同濃度ART干預(yù)48 h對NACC細(xì)胞

48 h后(×400) 穿膜細(xì)胞數(shù)侵襲能力的抑制作用

注：**P<0.01，***P<0.001。

3.3青蒿琥酯對NACC細(xì)胞SP1蛋白表達(dá)的影響采用Western Blot法，進(jìn)行蛋白含量檢測。相對灰度值空白對照組(2.14±0.06)、37.5 μmol·L-1ART組(1.89±0.05)、150 μmol·L-1ART組(1.66±0.03)、600 μmol·L-1ART組(1.42±0.04)、陽性對照組(0.79±0.11)，結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組于空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組組間比較均有差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=200.998，P<0.001(圖2A、2B)。

圖2A　不同濃度ART干預(yù)NACC細(xì)胞

圖2B　不同濃度ART干預(yù)NACC細(xì)胞48 h

注：***P<0.001。

4討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)各種因子間相互作用有著密切的關(guān)系，在眾多因子之中，轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)起著重要的作用，它們通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)分子、促癌及抑癌基因，影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SP1蛋白屬于Sp/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族，具有調(diào)控眾多基因表達(dá)的能力，正常情況下，SP1蛋白在體內(nèi)各種細(xì)胞中均有較穩(wěn)定的表達(dá)，并對多種管家基因具有調(diào)控的功能[8-9]，會(huì)隨著細(xì)胞的老化而逐漸減少表達(dá)。而在乳腺癌[10]、甲狀腺癌等腫瘤組織中，SP1蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常組織的表達(dá)水平。有研究表明SP1蛋白的表達(dá)水平也影響著血管形成[11]，進(jìn)而影響到腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。而下調(diào)SP1的表達(dá)能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長。因此SP1被公認(rèn)為一個(gè)重要的促癌蛋白。

前期研究[5]中通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯通過抑制劃痕愈合的方式表明其對腺樣囊性癌NACC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的抑制作用，同時(shí)較低濃度的青蒿琥酯可以將NACC細(xì)胞阻滯在G1期，而當(dāng)濃度達(dá)到50 mg·L-1時(shí)則可以將NACC細(xì)胞阻滯與G2期。本研究中，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用青蒿琥酯干預(yù)NACC細(xì)胞，在作用24 h后，即表現(xiàn)出對NACC細(xì)胞增殖的有效抑制，伴隨作用時(shí)間的延長，抑制NACC細(xì)胞增殖的效果也愈發(fā)明顯，且呈現(xiàn)濃度依賴性，與前期研究結(jié)果相符，600 μmol·L-1的青蒿琥酯與5 μmol·L-1的順鉑作用效果比較接近；侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，青蒿琥酯能有效抑制NACC細(xì)胞降解細(xì)胞周圍基質(zhì)并向周圍組織浸潤的能力，起到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的作用。

通過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯作用于NACC細(xì)胞系后，成功的抑制了NACC細(xì)胞在體外的增殖和侵襲的能力，且具有濃度依賴性，這一結(jié)果同Western Blot檢測SP1蛋白表達(dá)水平的結(jié)果保持較高的一致性，青蒿琥酯濃度越高，SP1蛋白表達(dá)水平下降的越明顯，說明青蒿琥酯可以有效降低促癌蛋白SP1的表達(dá)；結(jié)合Schulze[12]對前列腺癌AKR1C3S基因啟動(dòng)子同SP1間關(guān)系的研究，以及Sankpal等[13]通過靶向抑制SP1的表達(dá)治療前列腺癌的研究等眾多研究結(jié)果，我們認(rèn)為青蒿琥酯抑制腺樣囊性癌增殖與侵襲的作用與NACC細(xì)胞SP1蛋白表達(dá)水平下降可能存在重要的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討青蒿琥酯抑制腫瘤增殖侵襲作用的機(jī)制，將青蒿琥酯應(yīng)用于腺樣囊性癌治療提供了體外實(shí)驗(yàn)的支持。

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CHEN Yu-lin1, CHEN Hu1, LI Jia-quan2, et al

(1.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery，CollegeofStomatology;

2.MedicalScienceResearchCenter，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Abstract:Objective To explore the effect of artesunate (ART) on proliferation and invasion of novel human palatal salivary gland cell line of adenoid cystic carcinoma (NACC). MethodsThe changes of in vitro proliferation of NACC cells after being intervened for 24 and 48 hours by 37.5,150,600 μmol·L-1ART were analyzed by using MTT assay; the anti-invasion effect of ART at 37.5,150,600 μmol·L-1were tested by Transwell assay; the expression level of SP1 protein in each group was detected by Western Blot method. All experiments were performed with a control group and a positive control group with 5 μmol·L-1DDP.ResultsCompared with the control group, the effect of ART on the proliferation of NACC cells was significantly increased after treated for 24 hours (F=12.071,P<0.001), and the inhibition was more obvious than that by extending the intervention time to 48 hours (F=169.098,P<0.001). In Transwell assay, the number of cells passing through the membrane in experimental group (37.5,150,600 μmol·L-1ART groups) was significantly decreased, compared with the control group (F=139.939，P<0.001).Western Blot results showed that the expression levels of SP1 protein in 37.5,150,600 μmol·L-1ART and 5 μmol·L-1DDP positive control group were decreased (F=200.998,P<0.001), compared with the blank control group. ConclusionsArtesunate could effectively inhibit the NACC cell proliferation and invasive ability, and down-regulate the expression of transcription factor SP1.

Key words:artesunate;adenoid cysticcarcinoma;proliferation;invasion;transcription factor;SP1

收稿日期：(2015-10-12，修回日期：2015-11-23)

通信作者：農(nóng)曉琳，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：口腔頜面外科，E-mail：lab．nong@gmail.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 81360404)；廣西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 2013GXNSFAA019231)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.006