耐甲氧西林金黃色葡萄球菌DNA提取方法的改進(jìn)*

金　姝，鄒玉涵，閆佩毅，黃德魁，張　驥△

(1．上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200060；2.安徽醫(yī)科大學(xué)上海普陀臨床學(xué)院，上海 200060；

3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200060)

?

·論著·

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌DNA提取方法的改進(jìn)*

金姝1，2，鄒玉涵1，2，閆佩毅1，2，黃德魁2，3，張?bào)K1，2△

(1．上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200060；2.安徽醫(yī)科大學(xué)上海普陀臨床學(xué)院，上海 200060；

3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200060)

摘要:目的研究適用于PCR法檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的核酸提取方法。方法MRSA在不同孵育條件下分別經(jīng)含溶菌酶、溶葡萄球菌酶或chelex100R的裂解液裂解獲得DNA，用PCR法檢測(cè)目的基因。結(jié)果同時(shí)使用溶菌酶、溶葡萄球菌酶、chelex100R裂解得到的DNA，在用PCR法檢測(cè)mecA基因時(shí)，獲得的循環(huán)閾值(Ct值)明顯低于其他組分的裂解液。采用56 ℃一步法孵育裂解細(xì)菌的效果，與37、56 ℃二步法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但簡(jiǎn)化了步驟。結(jié)論含溶菌酶、溶葡萄球菌酶、chelex100R等的裂解液同時(shí)與細(xì)菌于56 ℃孵育30 min的方法，是獲取MRSA細(xì)菌DNA既便捷又高效的方法，可以立即用于下一步PCR，為PCR法快速檢測(cè)臨床MRSA感染奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；聚合酶鏈反應(yīng)；脫氧核糖核酸提取

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)在臨床金黃色葡萄球菌中的分離率已超過(guò)50%，用分子生物學(xué)方法可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)MRSA進(jìn)行快速診斷[1-2]，其靈敏度有賴于標(biāo)本制備的效果[3]。現(xiàn)有的酚/氯仿沉淀法、密度梯度離心法、離子交換層析法等步驟繁瑣，不適合用于日常大量標(biāo)本的檢測(cè)。為滿足臨床MRSA快速檢測(cè)的要求，本研究采用溶菌酶、溶葡萄球菌酶、蛋白酶K裂解細(xì)菌獲取核酸，同時(shí)采用chelex100樹(shù)脂有效去除非核酸有機(jī)物，并通過(guò)PCR法檢測(cè)MRSA的耐藥基因mecA，鑒定了一種優(yōu)良的細(xì)菌裂解溶液和方法，為PCR法快速檢測(cè)MRSA奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑三羥甲基氨基甲烷(Tris)、Triton X-100、溶菌酶、溶葡萄球菌酶、蛋白酶K等均購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；Na2-EDTA、弱陽(yáng)離子螯合樹(shù)脂(chelex100R)等購(gòu)自Sigma公司；PCR反應(yīng)液Premix Ex TaqTM (2×)購(gòu)自羅氏公司；引物和探針均由上海基康公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌混懸液的準(zhǔn)備取臨床分離的MRSA菌株R92，稀釋至2.0 麥?zhǔn)蠁挝?，濃度約6×108CFU/mL。每支試管取0.5 mL(細(xì)菌約3×108CFU)，12 000 r/min離心10 min，棄上清后加入裂解液。

1.2.2裂解方法方法1：細(xì)菌沉淀用90 μL TEX裂解液混懸，TEX裂解液包括20 mmol/L Tris(pH 8.0)、2 mmol/L Na2-EDTA、1.0%(v/v) Triton x-100、20 mg/mL溶菌酶(溶菌酶粉劑最后加入溶液中)?；鞈乙涸?7 ℃孵育30 min后，加入20 mg/mL的蛋白酶K溶液10 μL，56 ℃孵育30 min后，100 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液2 μL用于PCR反應(yīng)。方法2：與方法1相似，但無(wú)需37 ℃孵育30 min的步驟。方法3：與方法1相似，但裂解緩沖液中加入終濃度5%(v/v)chelex100。方法4：與方法2相似，但裂解緩沖液中加入終濃度5%(v/v)chelex100。方法5：與方法3相似，但裂解緩沖液中再加入10 μL 1 mg/mL的溶葡萄球菌酶(終濃度0.1 mg/mL)。方法6：與方法4相似，但裂解緩沖液中再加入10 μL 1 mg/mL的溶葡萄球菌酶(終濃度0.1 mg/mL)。方法7：將1.2.1中的6×108CFU/mL細(xì)菌混懸液用生理鹽水依次10倍稀釋至6×101CFU/mL，每個(gè)濃度取0.4 mL，12 000 r/min離心10 min，棄上清后的細(xì)菌沉淀的處理與方法2相似，但是裂解緩沖液中加入10 μL 1 mg/mL的溶葡萄球菌酶。方法8：與方法7相似，但是裂解緩沖液中再加入5%(v/v)chelex100。方法9：方法7中獲得的不同濃度的細(xì)菌沉淀，用上海之江生物有限公司MRSA診斷試劑盒中的DNA提取試劑處理。

1.2.3mecA基因的PCR擴(kuò)增體系20 μL的反應(yīng)體系為：Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL，20 μmol/L的上、下游引物各0.6 μL，20 μmol/L的探針0.2 μL，模板2 μL(DNA濃度為50～200 ng)，H2O 6.6 μL。

1.2.4mecA基因的PCR擴(kuò)增條件94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火及PCR反應(yīng)31 s，共40個(gè)循環(huán)，37 ℃ 10 s。

2結(jié)果

2.1孵育溫度及步驟的確定方法1、3、5采用37 ℃和56 ℃分別孵育30 min[二步法，循環(huán)閾值(Ct)值分別為29.87±2.71、19.55±1.94、16.11±1.44]，方法2、4、6采用56 ℃一次孵育30 min(一步法,Ct值分別為29.30±2.32、18.60±1.75、15.77±1.29)。按裂解液成分分組，每組組內(nèi)的一步法和二步法的結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即方法1與2，3與4，5與6無(wú)差異。但一步法的Ct值普遍低于二步法，說(shuō)明細(xì)菌在56 ℃一次孵育30 min既簡(jiǎn)化了操作步驟，也能獲得較好的裂解效果，細(xì)菌裂解液于56 ℃孵育30 min能更簡(jiǎn)便地獲取MRSA細(xì)菌DNA用于后續(xù)PCR檢測(cè)。

2.2裂解液組分的確定方法3、4較方法1、2中增加了chelex100，明顯降低了PCR反應(yīng)的Ct值，方法5、6在3、4基礎(chǔ)上增加溶葡萄球菌酶，PCR反應(yīng)的Ct值進(jìn)一步降低。按裂解液分組，每組組內(nèi)的一步法和二步法均和另兩組的4種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綜合方法1～6的結(jié)果可見(jiàn)，方法5和6裂解細(xì)菌獲得的DNA能較早地檢測(cè)到目的基因，而方法6作為一步法最為簡(jiǎn)便。在裂解液中增加chelex100R和溶葡萄球菌酶獲得的DNA有利于檢測(cè)mecA基因。

2.3裂解效果的線性驗(yàn)證為了驗(yàn)證方法6對(duì)不同濃度MRSA的效果，將3.0×103～3.0×107CFU的MRSA用方法6裂解后，PCR檢測(cè)mecA基因，見(jiàn)表1、圖1(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。細(xì)菌濃度與檢測(cè)的Ct值有較好的線性關(guān)系，r2=0.981 6。說(shuō)明在細(xì)菌數(shù)量為3.0×103～3.0×107CFU時(shí)，方法6裂解細(xì)菌獲得的核酸在PCR檢測(cè)mecA基因時(shí)有較好的線性結(jié)果。

表1　　裂解效果的線性驗(yàn)證結(jié)果

2.4驗(yàn)證chelex100R樹(shù)脂對(duì)細(xì)菌裂解效果的影響前述方法中發(fā)現(xiàn)在含chelex100R(方法3、4)的裂解液中再加入溶葡萄球菌酶(方法5、6)，明顯降低了PCR反應(yīng)的Ct值，說(shuō)明了溶葡萄球菌酶的作用。而在含溶葡萄球菌酶(方法7)的裂解液中再加入chelex100R樹(shù)脂(方法8)也能夠明顯降低Ct值，說(shuō)明chelex100R樹(shù)脂能增加檢測(cè)靈敏度。同時(shí)方法8裂解后的細(xì)菌獲得的Ct值也明顯低于方法9的商品化試劑盒的裂解方法。見(jiàn)表2。

方法細(xì)菌數(shù)量2.4×1072.4×1062.4×1052.4×1042.4×103方法724.74±2.16*30.63±2.92*33.57±3.04*34.92±3.11*36.36±3.95*方法821.61±2.2725.37±2.0827.34±2.1329.80±2.9730.03±2.41方法924.09±2.66*27.26±2.3729.86±3.07*31.93±3.64*33.48±3.35*

*：P<0.05，相同細(xì)菌濃度下與方法8比較。

3討論

金黃色葡萄球菌屬革蘭陽(yáng)性菌，其細(xì)胞壁較厚(20～80 nm)，有5～15層肽聚糖，而革蘭陰性菌細(xì)胞壁僅8～11 nm，只有1～2層肽聚糖。獲取細(xì)菌核酸需要破壞細(xì)胞壁、降解蛋白、溶解脂質(zhì)，革蘭陰性菌僅在Tris緩沖液中煮沸加熱即可達(dá)到裂解細(xì)菌獲取DNA的目的，而單純煮沸金黃色葡萄球菌無(wú)法破壞其細(xì)胞壁，需要更有效的專一性酶來(lái)裂解。采用溶菌酶、溶葡萄球菌酶裂解細(xì)菌較煮沸法效果好[3]，但煮沸裂解法也并沒(méi)有對(duì)核酸進(jìn)行沉淀及純化，溶液中復(fù)雜的成分不利于后續(xù)直接PCR反應(yīng)。因此分子生物學(xué)方法檢測(cè)MRSA的工作基礎(chǔ)是基因組DNA的提取，找到核酸提取操作的簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)廉和高產(chǎn)的方法。

核酸提取的方法主要有以下幾類，包括煮沸裂解法、酚/氯仿沉淀法、密度梯度離心法、離子交換層析法、硅膜吸附法和磁珠分離法等[4]。其中酚/氯仿沉淀法、密度梯度離心法和離子交換層析法費(fèi)時(shí)、繁瑣、有機(jī)溶劑污染環(huán)境，但核酸純度高；磁珠分離法成本高；硅膜吸附法雖然成本相對(duì)低，但步驟仍繁瑣，不適用于日常大量的檢測(cè)。本研究在于快速獲取適合于PCR反應(yīng)的MRSA DNA，而且標(biāo)本制備過(guò)程簡(jiǎn)單，僅需加入裂解液后孵育、離心，上清即可用于PCR，避免了繁瑣的反復(fù)加液、離心、吸棄上清、洗滌等步驟，最大程度地保留了所有細(xì)菌中的核酸。

本研究首次嘗試了將溶菌酶、溶葡萄球菌酶、蛋白酶K和chelex100R樹(shù)脂共同使用，破壞細(xì)胞壁、降解蛋白、螯合溶液中的非核酸有機(jī)物和陽(yáng)離子同時(shí)進(jìn)行。有研究報(bào)道chelex100R樹(shù)脂提取的DNA純度和完整性雖不如有機(jī)

溶劑提取法，但其在后續(xù)擴(kuò)增目的基因的PCR反應(yīng)中有更好的效果，還避免了繁瑣的技術(shù)勞動(dòng)和有毒的有機(jī)溶劑[5]。有研究在提取腦脊液的肺結(jié)核分枝桿菌DNA時(shí)，用含chelex100和蛋白酶K的緩沖液56 ℃孵育前，用溶菌酶37 ℃孵育1 h并未改善檢測(cè)的靈敏度，其最低檢測(cè)限從104～105CFU細(xì)菌反而升至105～106CFU細(xì)菌[6]。因此本文繼續(xù)研究了當(dāng)chelex100R和蛋白酶K與溶菌酶等酶同時(shí)應(yīng)用時(shí)的反應(yīng)條件。

本研究分析顯示含溶菌酶、溶葡萄球菌酶、chelex100R樹(shù)脂、蛋白酶K的裂解液同時(shí)與細(xì)菌于56℃孵育30min，是獲取MRSA細(xì)菌DNA既便捷又高效的方法[7]，溶葡萄球菌酶和chelex100R樹(shù)脂降低PCR反應(yīng)Ct值的效果非常明顯，提高了檢測(cè)能力，該方法可用于細(xì)菌定量檢測(cè)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)以上所有成分56 ℃一步法裂解的效果最佳，不同于研究者們通常采用的方法，即細(xì)菌經(jīng)溶菌酶和溶葡萄球菌酶37 ℃孵育后，再用蛋白酶K56 ℃孵育[8]。本研究方法可以立即用于下一步PCR，如用于日常檢測(cè)能大大縮短標(biāo)本處理時(shí)間，提高檢測(cè)效率，為PCR法快速檢測(cè)臨床MRSA感染奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]史小英，陳啟容，余新玉，等．ICU耐甲氧西林金黃色葡萄球菌快速監(jiān)測(cè)及防控[J]．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36(7)：877-879．

[2]Grisold AJ,Leitner E,Mühlbauer G,et al.Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and simultaneous confirmation by automated nucleic acid extraction and real-time PCR[J].J Clin Microbiol,2002,40(7):2392-2397.

[3]湯一葦，白春學(xué)，倪語(yǔ)星，等．微生物分子診斷學(xué)[M]．北京：科學(xué)出版社，2013．

[4]Nagdev KJ,Kashyap RS,Deshpande PS,et al.Determination of polymerase chain reaction efficiency for diagnosis of tuberculous meningitis in chelex100 extracted DNA samples[J].Int J Tuberc Lung Dis,2010,14(8):1032-1038.

[5]Zucol F,Ammann RA,Berger C,et al.Real-time quantitative broad-range PCR assay for detection of the 16S rRNA gene followed by sequencing for species identification[J].J Clin Microbiol,2006,44(8):2750-2759.

[6]Zhao J,Carmody LA,Kalikin LM,et al.Impact of enhanced Staphylococcus DNA extraction on microbial community measures in cystic fibrosis sputum[J].PLoS One,2012,7(3):e33127.

[7]金姝,朱晴暉,鄒玉涵,等.一種提取耐甲氧西林金黃色葡萄球菌DNA的方法[P].中國(guó):ZL201310124795.2,2015-01-14.

[8]López M,Rivera MG,Viettri M,et al.Comparing two protocols of DNA extraction of Trypanosoma cruzi cultured in axenic medium[J].Rev Peru Med Exp Salud Publica,2014,31(2):222-227.

Improvement on DNA extraction method of methicillin resistant Staphylococcus aureus*

JinShu1，2,ZouYuhan1，2,YanPeiyi1，2,HuangDekui2，3,ZhangJi1，2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,PutuoDistrictofPeople′sHospital,Shanghai200060,China;2.Shanghai

PutuoClinicalCollege,AnhuiMedicalUniversity,Shanghai200060,China;3.Department

ofCardiology,PutuoDistrictofPeople′sHospital,Shanghai200060,China)

Abstract:ObjectiveTo study a nucleic acid extraction method suitable for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) by PCR method.MethodsUnder different incubation conditions,MRSA was cracked by lysozyme,lysostaphin or chelex100R resin for obtaining DNA,then the target gene was detected by using the PCR method.ResultsDNA was obtained by simultaneously using lysozyme,lysostaphin and chelex100R resin solution,the obtained Ct value was significantly lower than that of the other components of schizolysis solutions when PCR was used to detect mecA gene of obtained DNA.There was no statistically significant difference between adopting the 56 ℃ one-step method and the 37 ℃ and 56 ℃ two-step method for conducting MRSA schizolysis(P>0.05),but the steps were simplified.ConclusionIncubating MRSA in solution containing lysozyme,lysostaphin,chelex100R resin for 30 min at 56 ℃ is the convenient and efficient schizolysis method to extract DNA,which can be used immediately for the next step of PCR and lays the foundation for PCR rapid detection of clinical MRSA infection.

Key words:methicillin resistant Staphylococcus aureus;polymerase chain reaction;DNA extraction

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.006

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)03-0303-03

通訊作者△，E-mail:zhangji196678@aliyun.com。

作者簡(jiǎn)介：金姝，女，副主任檢驗(yàn)師，主要從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)及分子檢驗(yàn)研究。

*基金項(xiàng)目：上海市普陀區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)自主創(chuàng)新科研資助項(xiàng)目(普KW11103)。