鼠源性抗星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1單克隆熒光抗體在惡性漿膜腔積液檢測(cè)中的應(yīng)用*

路　蔓，龍　敏，劉　沖，陳　曦，王　琛，張惠中

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)科，陜西西安 710038)

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·論著·

鼠源性抗星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1單克隆熒光抗體在惡性漿膜腔積液檢測(cè)中的應(yīng)用*

路蔓，龍敏，劉沖，陳曦，王琛，張惠中

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)科，陜西西安 710038)

摘要:目的應(yīng)用鼠源性抗星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1(AEG-1)單克隆熒光抗體檢測(cè)惡性漿膜腔積液中的腫瘤細(xì)胞。方法應(yīng)用PCR及Western-blot方法檢測(cè)漿膜腔積液脫落細(xì)胞中的AEG-1表達(dá)；用鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體與惡性漿膜腔積液中的腫瘤細(xì)胞共孵育，同時(shí)采用良性病變的漿膜腔積液作為陰性對(duì)照。結(jié)果惡性漿膜腔積液脫落細(xì)胞中AEG-1表達(dá)呈陽(yáng)性，而良性病變的漿膜腔積液脫落細(xì)胞中AEG-1表達(dá)為陰性或弱陽(yáng)性；同時(shí)鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體直接標(biāo)記脫落細(xì)胞的結(jié)果與PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體為漿膜腔積液中的腫瘤細(xì)胞鑒定提供了新的實(shí)驗(yàn)手段。

關(guān)鍵詞:鼠源性抗星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1；單克隆抗體；熒光標(biāo)記；漿膜腔積液

星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1(AEG-1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的癌基因，Emdada等[1]于2009年對(duì)其做了進(jìn)一步證實(shí)。該基因位于與多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的人類(lèi)8號(hào)染色體(8q22)上，進(jìn)一步研究表明其是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因子[2-3]。相關(guān)研究表明，AEG-1基因與多種惡性腫瘤，如肝細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。另有研究表明,人AEG-1基因的啟動(dòng)子(-2710/+49)缺少TATA或CAAT盒，但含有多個(gè)Spl基序并富含GC序列，其中Spl基序可以與核因子-κB(NF-κB)相互作用，可能是AEG-1發(fā)揮功能的重要片段[5-6]?，F(xiàn)已證實(shí)AEG-1是Ras/PI3K/Akt/c-Myc信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶分子，可以通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin、 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多條信號(hào)途徑參與正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，血管生成等多個(gè)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的環(huán)節(jié)，并能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬活性和化療耐藥。該基因?qū)Χ喾N惡性腫瘤的診斷和預(yù)后具有重要的臨床意義，可能成為腫瘤治療和抗癌藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得1株能穩(wěn)定分泌抗AEG-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(IE3)。本研究培養(yǎng)IE3細(xì)胞小鼠，腹腔內(nèi)注射制備腹水，提取并純化單克隆抗體，并用異硫氰酸熒光素(FITC)對(duì)單克隆抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源收集臨床確診為惡性腫瘤，且常規(guī)中能查見(jiàn)大量異形有核細(xì)胞的漿膜腔積液，其中診斷為卵巢癌患者的腹水標(biāo)本13份，診斷為肺癌并全身轉(zhuǎn)移患者的胸腔積液標(biāo)本17份。并收集良性病變的漿膜腔積液作為陰性對(duì)照，其中診斷為肝硬化患者的腹水標(biāo)本22份，診斷為心力衰竭患者的胸腔積液標(biāo)本8份。

1.2儀器與試劑2720型PCR儀由美國(guó)基因泰克工程技術(shù)公司提供，DYY-8C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀、DYCP-40C半干式碳板轉(zhuǎn)移槽由北京六一生物科技有限公司提供，凝膠圖像分析儀由美國(guó)阿爾法科技有限公司提供，UBR4型干浴器由Grant Brother公司提供，BCD-628WACW冰箱由海爾公司提供，超凈工作臺(tái)由富康公司提供，生化培養(yǎng)箱由重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠提供。DNA標(biāo)記物由西安潤(rùn)德公司生物技術(shù)有限公司提供；Protein標(biāo)記物由美國(guó)Thermo scientific公司提供；山羊抗小鼠二抗由中山生物技術(shù)有限公司提供；FITC及二甲基亞砜(DMSO)由美國(guó)Sigma公司提供；RNAiso Plus及反轉(zhuǎn)錄試劑盒由日本TaKaRa公司提供；氯仿、異丙醇、75%乙醇由天津市津北精細(xì)化工有限公司提供。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1AEG-1蛋白檢測(cè)收集胸腔積液及腹水細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR檢測(cè)AEG-1。(1)收集漿膜腔積液中的細(xì)胞提取RNA。①將胸腔積液及腹水離心收集細(xì)胞，3 000 r/min離心10 min，棄上清。②收集細(xì)胞，移入1.5 mL離心管中，加入1 mL RNAiso Plus，混勻放置10 min。③加入200 μL氯仿，震蕩混勻15 s以上，室溫放置5 min，離心(4 ℃，14 000 r/min，10 min)。④離心后液體分層，上層無(wú)色液體含RNA，小心吸取上層無(wú)色液體移入新的1.5 mL離心管中。⑤加入等體積異丙醇，混勻，15～30 ℃下孵育10～30 min，離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)。⑥去上清，沉淀加入75%乙醇1 mL，震蕩30 s,離心(4 ℃，7 500 r/min，5 min)。⑦小心去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺(tái)中鼓風(fēng)干燥3～5 min。⑧加入20 μL焦磷酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解沉淀。(2)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄20 μL體系為：提取細(xì)胞的RNA模板2 μL、5×prime script 4 μL、ddH2O 14 μL。PCR擴(kuò)增:37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ ∞。(3) PCR檢測(cè)AEG-1蛋白。Mix 20 μL體系為：2×Taq Mix 10 μL、ddH2O 8 μL、引物異黏蛋白(MTDH)1 μL、模板cDNA 1 μL。

1.3.2Western-blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白(1)收集漿膜腔積液中的脫落細(xì)胞提取蛋白。①將胸腔積液及腹水離心收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液清洗一遍。②加入200 μL細(xì)胞裂解液、2 μL DMSO，4 ℃搖床30 min裂解細(xì)胞。③離心(4 ℃，14 000 r/min，15 min)，取上清。(2)Western-blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白。將漿膜腔積液細(xì)胞裂解蛋白上樣，用純化后的抗AEG-1單克隆抗體作為一抗(1∶500稀釋)，用山羊抗小鼠作為二抗(1∶5 000稀釋)。

1.3.3鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體檢測(cè)惡性漿膜腔積液中的腫瘤細(xì)胞(1)取新鮮抽取的漿膜腔積液1 mL，加入2 μL鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體(1∶500稀釋)。(2)37 ℃避光搖床100 r/min反應(yīng)30 min。(3)用磷酸鹽緩沖液離心(1 200 r/min，5 min)清洗3遍，除去未結(jié)合上的熒光單克隆抗體。(4)壓片，熒光顯微鏡鏡檢。

2結(jié)果

2.1病理科脫落細(xì)胞檢測(cè)卵巢癌及肺癌患者漿膜腔積液的脫落細(xì)胞中查見(jiàn)腫瘤細(xì)胞。

2.2PCR檢測(cè)AEG-1表達(dá)收集漿膜腔積液中的細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR檢測(cè)AEG-1，見(jiàn)圖1。惡性漿膜腔積液脫落細(xì)胞中AEG-1呈陽(yáng)性，而良性病變的漿膜腔積液脫落細(xì)胞中AEG-1呈陰性或弱陽(yáng)性。

1、6：肝硬化腹水β-actin、AEG-1結(jié)果；2、7：心力衰竭胸腔積液β-actin、AEG-1結(jié)果；3、8：卵巢癌腹水β-actin、AEG-1結(jié)果；4、9：肺癌胸腔積液β-actin、AEG-1結(jié)果；M:蛋白標(biāo)記物。

圖1PCR檢測(cè)AEG-1表達(dá)

2.3Western-blot檢測(cè)漿膜腔積液細(xì)胞AEG-1表達(dá)細(xì)胞蛋白檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。惡性漿膜腔積液脫落細(xì)胞中AEG-1呈陽(yáng)性，而良性病變的漿膜腔積液脫落細(xì)胞中AEG-1呈陰性或弱陽(yáng)性，與PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。

1:肝硬化腹水細(xì)胞裂解蛋白；2:心力衰竭胸腔積液細(xì)胞裂解蛋白；3:卵巢癌腹水細(xì)胞裂解蛋白；4:肺癌胸腔積液細(xì)胞裂解蛋白；B：對(duì)應(yīng)4種細(xì)胞的β-actin結(jié)果。

圖2Western-blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白

2.4漿膜腔積液中的異形有核細(xì)胞鼠源性抗AEG-1單克隆熒光抗體檢測(cè)漿膜腔積液中的異形有核細(xì)胞結(jié)果見(jiàn)圖3～4(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。在惡性漿膜腔積液中，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗AEG-1單克隆抗體可與脫落的腫瘤細(xì)胞膜表面的AEG-1特異性結(jié)合，而在良性病變的漿膜腔積液中呈陰性。抗AEG-1單克隆熒光抗體直接標(biāo)記脫落細(xì)胞的結(jié)果與PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果一致。

3討論

AEG-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的癌基因。到目前為止的惡性腫瘤研究中，AEG-1表達(dá)于多種相關(guān)組織惡性腫瘤，包括肝細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、食管鱗狀細(xì)胞癌(ESSC)、黑色素瘤、多形性膠質(zhì)瘤(GBM)等，但其在正常組織和良性病變中表達(dá)不明顯[7-11]。對(duì)比分析癌組織和良性病變組織，已經(jīng)確定AEG-1是一項(xiàng)潛在的診斷癌癥及判斷預(yù)后的指標(biāo)。漿膜腔積液是在疾病情況下，胸腔、腹腔或心包腔內(nèi)集聚的過(guò)多液體的總稱(chēng)，是一種常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象。最常見(jiàn)病因?yàn)閻盒阅[瘤(31.3%)，其次為結(jié)締組織疾病、結(jié)核、肝硬化、心功能不全等。由于AEG-1是一個(gè)在大多數(shù)惡性腫瘤中均表達(dá)的基礎(chǔ)性癌基因，因此檢測(cè)脫落細(xì)胞的AEG-1即可辨別漿膜腔積液的性質(zhì)，且具有很高的特異度。

雜交瘤技術(shù)是將經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP-20)在體外融合在一起，融合后的雜交瘤細(xì)胞兼有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖和脾細(xì)胞分泌抗體的能力。這種細(xì)胞通過(guò)克隆化即可成為單克隆系，能產(chǎn)生大量針對(duì)同一抗原決定簇的抗體，這種抗體就稱(chēng)為單克隆抗體。與多克隆抗體相比，單克隆抗體的特點(diǎn)是理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，且便于人為處理和質(zhì)量控制，這些優(yōu)點(diǎn)使它一問(wèn)世就受到高度重視。目前為止，人們已經(jīng)研究出各種單克隆抗體，其應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生、環(huán)境等眾多領(lǐng)域，單抗藥物的開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)的新熱點(diǎn)。單克隆抗體廣泛用于基礎(chǔ)研究，疾病的診斷治療、預(yù)防，環(huán)境與食品衛(wèi)生的檢測(cè)，提純蛋白，優(yōu)生優(yōu)育，而且隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，將出現(xiàn)更加廣闊的前景。

本研究將鼠源性抗AEG-1單克隆抗體FITC標(biāo)記可放大信號(hào)，有利于臨床檢測(cè)。在惡性漿膜腔積液中，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗AEG-1單克隆抗體可與脫落的腫瘤細(xì)胞膜表面的AEG-1特異性結(jié)合，而在良性病變的積液中呈陰性，結(jié)

果提示，該熒光標(biāo)記抗體具有腫瘤特異性，可為臨床惡性漿膜腔積液的早期診斷提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Application of mouse anti AEG-1 monoclonal fluorescent antibody in malignant serous cavity effusions*

LuMan,LongMin,LiuChong,ChenXi,WangChen,ZhangHuizhong

(DepartmentofClinicalExperimentandLaboratory,TangduHospitalofFourth

MilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China)

Abstract:ObjectiveTo use mouse astrocytes elevated gene-1(AEG-1) monoclonal fluorescent antibody for detecting tumor cells in malignant serous cavity effusions.MethodsThe expression of AEG-1 in serous cavity effusion exfoliated cells by PCR and Western-blot;the mouse monoclonal anti-AEG-1 fluorescent antibody and tumor cells in malignant serous cavity effusions were co-incubated,meanwhile，the serous cavity effusions in benign lesions were taken as the negative control.ResultsThe AEG-1 expression was positive in malignant serous cavity effusions exfoliated cells,while which in benign lesion serous cavity effusion was negative or weakly positive;meanwhile the results of direct labelling in mouse anti AEG-1 monoclonal antibodies were consistent with the results by PCR and Western-blot.ConclusionMouse anti AEG-1 monoclonal fluorescence antibody can provide certain theoretical basis for the detection of tumor cells in serous cavity effusion.

Key words:mouse astrocytes elevated gene-1;monoclonal antibodies;fluorescently labeling;effusion

(收稿日期：2015-09-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.001

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)03-0289-03

作者簡(jiǎn)介：路蔓，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)研究。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81201525)。