哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞的測定及臨床意義

湛潔誼，盧慧敏，林穗玲

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 兒科，廣東 廣州510120；2.廣州天河區(qū)婦幼保健院 檢驗科，廣東 廣州510610)

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哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞的測定及臨床意義

湛潔誼1，盧慧敏1，林穗玲2

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 兒科，廣東 廣州510120；2.廣州天河區(qū)婦幼保健院 檢驗科，廣東 廣州510610)

摘要：目的探討CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞在哮喘兒童外周血中的比例改變，并探討其臨床意義。方法150例哮喘患兒按臨床表現(xiàn)分為急性發(fā)作組(50例)、臨床緩解期組(50例)和咳嗽變異性哮喘組(50例)，另選擇50名健康兒童為正常對照組。應用流式細胞儀檢測上述各組外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的百分比。結果急性發(fā)作期組患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞水平較緩解組、咳嗽變異性哮喘組及健康對照組明顯下降(P<0.05)，而緩解期組及咳嗽變異性哮喘組與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞可能參與了哮喘的發(fā)生與發(fā)展，哮喘的嚴重程度可能與CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞的水平相關。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0078)

CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)是一類調節(jié)或抑制其他免疫細胞功能的細胞。近年來，研究資料顯示，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在哮喘的發(fā)病中可能起著重要作用。在過去的研究中，多數(shù)以CD25+來界定調節(jié)性T細胞，但這樣得到的調節(jié)性T細胞可能會不完整，因為經免疫激活的效應性T細胞CD25的表達也會上調，導致較難區(qū)分調節(jié)性T細胞和效應性T細胞。近期研究提示CD127的低表達(CD4+CD25nt/hiCD127loTreg)能較好地反映完整的調節(jié)性T細胞。目前關于CD4+CD25nt/hiCD127loTreg與哮喘的研究不多，特別是未見咳嗽變異性哮喘與CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的研究。該文通過檢測不同時期及不同類型哮喘患者外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的表達水平，探討該細胞表達水平與哮喘發(fā)病的關系。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2010-2013年廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院兒科門診哮喘患者150例，均符合2008年中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組制定的哮喘及其分期的診斷標準[1]。急性發(fā)作期哮喘患兒50例，年齡2-9歲；臨床緩解期哮喘患兒50例，年齡2.5-11歲；咳嗽變異性哮喘患兒50例，年齡3-10歲。對照組50例，為廣州市天河區(qū)婦幼保健院健康體檢兒童，年齡2-10歲，均無自身免疫性疾病、過敏性疾病以及腫瘤疾病史，近2個月內無感染性疾病，并除外近3個月內使用腎上腺皮質激素、免疫抑制劑或其他免疫調節(jié)劑史。各組的性別構成、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人的CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluro647及同型對照單抗，F(xiàn)AC lysing solution溶血素，流式細胞儀FACScanto，以上試劑及儀器均購自美國Becton Dickinson公司。分析軟件為FACSDiva software。

1.3外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的檢測抽取研究對象外周靜脈血2 ml，用EDTA抗凝。取兩支流式上樣管，分別加入EDTA抗凝全血50 μl，第一管加同型對照，第二管加CD4FITC、CD25PE、CD127 Alexa Fluro647，各為10 μl，室溫避光孵育15-20分鐘，然后加入FASC 溶血素1 ml，混合后避光靜置10分鐘，1 000 r/min離心3分鐘，加入2ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，加入適量PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。以CD4陽性細胞設門，分析CD4+CD25nt/hiCD127lo調節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的百分比。

2結果

2.1研究對象年齡、性別構成比較見表1。

表1　不同組別年齡及性別構成比較

2.2不同組別外周血中CD4+CD25nt/hiCD127loTreg占CD4+T細胞的比例比較急性發(fā)作期哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg占CD4+T細胞的比例明顯低于健康對照兒童、臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒(P<0.05)。臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒與健康對照兒童比較差異無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。臨床緩解期哮喘患兒與咳嗽變異性哮喘患兒比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2　不同組別外周血中CD4+CD25nt/hiCD127loTreg

注：*與急性發(fā)作組比較，P<0.05。

3討論

CD4+CD25+Treg是CD4+T細胞的一個小的細胞亞型，具有免疫無能性和抑制性兩大功能特征[2]。近年來，研究資料顯示，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在哮喘的發(fā)病中可能起著重要作用。在過去的研究中，多數(shù)界定CD4+CD25+T細胞為調節(jié)性T細胞，但這樣得到的調節(jié)性T細胞和效應T細胞有部分重疊，較難區(qū)分調節(jié)性T細胞和效應性T細胞[3]。根據(jù)CD4+T細胞表達CD25的程度不同，CD4+CD25+Treg可分為CD4+CD25hiTreg、CD4+CD25ntTreg(中等強度表達)和CD4+CD25-Treg。但具有免疫調節(jié)或抑制活性的細胞主要是中、高表達CD25+的CD4+T細胞(CD4+CD25nt/hiTreg)[4，5]。但由于對CD25nt/hh細胞設門具有主觀性，使得結果難以掌握。因此CD25nt/hi表型可能會低估或高估調節(jié)性T細胞的數(shù)量。近來認為叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子3(forkhead/winged helix transcription factor 3，F(xiàn)oxp3)是CD4+CD25+Treg細胞分化發(fā)育和功能維持的重要調控基因[6]。Foxp3主要表達于CD4+CD25highTreg，達97%左右[7]。Foxp3被認為是CD4+CD25+Treg的特異性標志物[8-11]。但由于FOXP3為核內蛋白，需要對細胞進行破膜，操作步驟繁瑣，實驗操作過程中影響因素較多[12]，因而限制了其臨床應用。最新研究表明CD127的低表達(CD4+CD25nt/hiCD127lo)與CD25中高表達Foxp3有良好的相關性[13，14]。細胞膜表面抗原CD127是IL-7受體的一部分。CD127在效應性T淋巴細胞和記憶T淋巴細胞活化后仍能持續(xù)表達，只在調節(jié)性T淋巴細胞表達下降，因此聯(lián)合應用CD25中高表達和CD127低表達，能夠有效去除CD25+T淋巴細胞中效應T淋巴細胞，從而反映調節(jié)型T淋巴細胞的數(shù)量。由于CD127為表面抗原，無需對胞內進行染色，操作較簡單，重復性好，且可保持細胞的完整性，使染色后的細胞仍可以進行培養(yǎng)等進一步的研究。所以CD4+CD25nt/hiCD127loTreg是識別調節(jié)性T淋巴細胞的一個重要標記。

該實驗研究表明，哮喘急性發(fā)作期患兒的外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平明顯低于臨床緩解期哮喘患兒、咳嗽變異性哮喘患兒和正常對照組兒童，與上官文姬[15]的報道一致，提示哮喘急性發(fā)作期患兒體內存在T調節(jié)細胞免疫功能平衡失調，導致抑制免疫功能減弱或呈低反應性，可能是引起支氣管哮喘發(fā)病的機制之一。而臨床緩解期哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。與上官文姬[16]的報道不一致，分歧的產生可能與疾病的狀態(tài)不同有關，哮喘患兒癥狀緩解可能與體內CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的水平恢復有關。同時咳嗽變異性哮喘患兒外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平與正常對照組比較差異也無統(tǒng)計學意義。這可能與咳嗽變異性哮喘患兒的病情較輕，CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平下降不明顯有關。該實驗研究表明哮喘的嚴重程度可能與CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平相關。目前尚未見咳嗽變異性哮喘與CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平關系的研究報道，尚需更大量的樣本驗證及進一步的研究。

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關鍵詞：哮喘；兒童；調節(jié)性T細胞；流式細胞術

The level of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells and its clinical significance in children with asthmaZHANJie-yi,LUHui-min，LINSuiling.(DepartmentofPediatrics,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniviersity,Guangdong510120,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the proportion change of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells(Treg)in peripheral blood of children withasthma and to analyze its significance.Methods150 asthmatic children were divided into three groups according to their clinicalfeatures：50 subjects in acute asthma attack group,50 subjects in clinical remission of asthma group and 50 subjects in cough variant asthma group，meanwhile,50 healthy children were enrolled in the control group.The levels of CD4+CD25nt/hiCD127loTreg in peripheral blood of all children were detected by flow cytometer.ResultsThe CD4+CD25nt/hiCD127loTreg level in acute attack group were lowest of the four groups (P<0.05),but the level in the control group was not significantly dif-ferent from the the clinical remission group and the cough variant asthma(allP>0.05).ConclusionThe CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells may be involved in the pathogenesis of asthma,The level of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells correlated with the severity of asthma in children.

Key words:Asthma；Children；Regulatory T cell；Flow cytometry

(收稿日期：2014-11-20)

作者簡介：湛潔誼(1967-)，女，廣東，畢業(yè)于廣州醫(yī)學院，本科學歷，碩士學位，主任醫(yī)師，研究方向為兒童呼吸系統(tǒng)疾病。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R562.2+5

文章編號：1007-4287(2016)01-0078-03

基金項目：廣東省衛(wèi)生廳立項課題(A2011253)