胃癌組織中VEGF-D及MLVD表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

鄧明佳　沈麗達(dá)　張麗娟

作者單位:650118 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院

胃癌組織中VEGF-D及MLVD表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

鄧明佳沈麗達(dá)張麗娟

作者單位:650118 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院

【摘要】目的探討胃癌患者腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子-D(vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D)及微淋巴管密度(micro-lymphatic vessel density，MLVD)與其生存期的關(guān)系。方法收集52例胃癌術(shù)后患者標(biāo)本，采用免疫組化方法檢測胃癌組織中VEGF-D、MLVD及胃癌癌旁MLVD。結(jié)合臨床病理資料，分析VEGF-D、MLVD與其生存期的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織VEGF-D陽性組生存期較陰性組短(P=0.048)，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；癌旁組織MLVD高組(≥10)較低組(<10)生存期短(P=0.001)，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；胃癌組織MLVD高組(≥10)較低組(<10)生存期短(P=0.067)，但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論胃癌組織中VEGF-D及胃癌癌旁MLVD可作為判斷胃癌預(yù)后的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長因-D；微淋巴管密度；免疫組織化學(xué)；預(yù)后；生存期

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:039～042)

胃癌是起源于胃粘膜上皮的惡性腫瘤，我國每年因胃癌死亡的患者居消化道腫瘤死因首位[1]。初診時75%的胃癌患者已發(fā)展為播散性疾病。胃癌患者的5年生存率約20%～30%[2]。胃癌預(yù)后的重要指標(biāo)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤侵犯深度等，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與淋巴管生成關(guān)系密切。近年來，最有代表性的淋巴管生成因子是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-C和VEGF-D。VEGF-D可刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)淋巴管生成[3]。于1998年研究者通過計算機(jī)同源性搜索在核酸數(shù)據(jù)庫中確定了VEGF家族的這個新成員[4]。成人血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)-3是淋巴管生成的特異性調(diào)節(jié)因子，主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF-D與VEGFR-3結(jié)合后，通過MEK/ERK和PI3激酶/Akt途徑引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生[5]。在生長初期，腫瘤通過簡單擴(kuò)散的方式獲得營養(yǎng)，淋巴管在其中扮演了重要角色。由此可見，淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移是判斷胃癌預(yù)后的重要指標(biāo)。目前，它在腫瘤淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移中的研究越來越多。本研究主要檢測胃癌的VEGF-D及MLVD，結(jié)合臨床資料分析胃癌VEGF-D和MLVD與生存期的關(guān)系，探討其臨床意義。

1材料與方法

1.1　一般資料

52例患者均來自云南省腫瘤醫(yī)院，均為2004年1月-2007年6月行手術(shù)的胃癌患者。其中男性30 例，女性22 例。年齡25～81歲，中位年齡62歲，≥60歲者20例，<60歲者32例。高、中分化胃癌18例；低分化胃癌34例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移者16例。Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期34例；52例患者術(shù)前均未行放、化療。

1.2　材料

所用抗體均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司：鼠抗人D2-40單克隆抗體(濃縮型，產(chǎn)品編號為MAB-0567)、兔抗人VEGF-D多克隆抗體(濃縮型，產(chǎn)品編號為RAB-0601)?？乖迯?fù)緩沖液：檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mmol/L，pH 6.0)、EDTA緩沖液(1 mmol/L，pH=8.0)按1:75的比例稀釋。其他試劑：二甲苯、10%福爾馬林液、3%雙氧水甲醇液、PBS(pH 7.2～7.4)液、增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、蒸餾水等。

1.3　方法

1.3.1組織標(biāo)本的處理和免疫組化染色選取外科手術(shù)切除且常規(guī)組織學(xué)確診為胃癌組織以及同一患者癌旁組織(腫瘤浸潤邊緣以外，距腫瘤<2 cm)，同時收集腫瘤切緣陰性、離病灶5 cm以上的正常胃組織52例為對照組。經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定新鮮標(biāo)本，常規(guī)脫水、浸蠟及石蠟包埋。HE染色片用于組織病理學(xué)診斷。形態(tài)典型的切片用于免疫組化染色。

1.3.2免疫組化結(jié)果判定陽性染色反應(yīng)的分級判斷標(biāo)準(zhǔn)。VEGF-D陽性物質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀，主要于細(xì)胞質(zhì)著色，個別病例癌細(xì)胞胞核及胞質(zhì)著色，偶見著色于脈管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。參照邢傳平等[6]免疫組化染色結(jié)果判定相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。本研究將弱陽性(+)、中度陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)合并為陽性(+)作統(tǒng)計分析。D2-40免疫組化染色計數(shù)MLVD。淋巴管判定標(biāo)準(zhǔn)：D2-40陽性染色定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。

1.3.3隨訪根據(jù)云南省腫瘤醫(yī)院病理科提供的患者住院號及姓名查找該患者的住院病歷，獲取有助于隨訪的其它資料包括家庭住址和電話，并且確定患者術(shù)前未行放療和化療。通過電話進(jìn)行隨訪，隨訪得到52例患者生存資料，隨訪時間為1～72個月。

1.4　統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1　胃癌組織VEGF-D陽性組和陰性組生存期比較

VEGF-D在胃癌組織和正常組織中呈不同程度表達(dá)，陽性物質(zhì)呈棕黃色細(xì)顆粒狀，多數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果顯示胃癌組織VEGF-D陽性組生存期較陰性組短(卡方值3.927，P=0.048)，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1，圖1。

表1　胃癌組織VEGF-D陽性組和陰性組生存情況

圖1　胃癌組織VEGF-D表達(dá)陽性與陰性患者生存期比較

2.2　癌旁組織MLVD高低患者生存期比較

癌旁組織MLVD高者較低者生存期短(卡方值10.145，P=0.001)，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2，圖2。

表2　癌旁組織MLVD高低患者生存期情況

圖2　癌旁組織MLVD高低患者生存期比較

2.3　胃癌組織MLVD高低患者生存期比較

胃癌組織MLVD高者較低者生存期短(卡方值3.352，P=0.067)，但兩者間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，見表3，圖3。

3　討論

淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移是胃癌最常見的播散方式。特異性淋巴管標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)后，人們對腫瘤淋巴管生成的研究可以更進(jìn)一步。D2-40作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞較為特異的標(biāo)記蛋白之一。用它標(biāo)記MLVD能反映腫瘤淋巴管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。但MLVD與胃癌生存期關(guān)系的研究很少，且未有定論[8-9]。血管內(nèi)皮生長因子-D (vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D)被認(rèn)為與腫瘤淋巴管生成密切相關(guān)，它與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

表3　胃癌組織MLVD高低患者生存期情況

圖3　胃癌組織MLVD高低患者生存期比較

3.1　胃癌組織VEGF-D的表達(dá)與生存的關(guān)系

本組研究顯示，胃癌組織VEGF-D陽性組生存期較陰性組短(P=0.048)，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。我們既往曾研究胃癌組織VEGF-D表達(dá)與臨床因素的關(guān)系，結(jié)果顯示胃癌組織無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-D的陽性率低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)。Ⅰ、Ⅱ期患者胃癌組織VEGF-D陽性率低于于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05)。癌旁組織無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-D的陽性率亦低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)，Ⅰ、Ⅱ期患者癌旁組織VEGF-D陽性率低于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05)?？烧J(rèn)為VEGF-D促進(jìn)了淋巴管增生，而淋巴管增生活躍導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移幾率增加，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高則腫瘤分期越晚，生存期也越短。Wang 等[8]研究認(rèn)為胃癌組織中VEGF-D、VEGF-C、VEGF-A的高表達(dá)致總生存期縮短。Deng 等[10]的研究認(rèn)為，VEGF-D是胃癌根治術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后因素，并且發(fā)現(xiàn)此類患者VEGF-D陽性者DFS較陰性者縮短。Liu等[11]研究顯示循環(huán)血中VEGF的表達(dá)較組織中的VEGF更能指導(dǎo)胃癌患者預(yù)后。國外亦有相關(guān)報道，Shida等[12]研究認(rèn)為，VEGF-D是胃癌患者RFS和OS的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。Jüttner等[13]認(rèn)為，VEGF-D、VEGFR-3是胃腺癌切除術(shù)后患者不良預(yù)后的指標(biāo)。但也有相反觀點(diǎn)，Schimanski等[14]研究顯示，胃腺癌患者組織VEGF-D的表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，但并未顯示其對生存期的影響。但也有較多試驗顯示，胃癌組織VEGF-D并非患者預(yù)后的可靠指標(biāo)[8,15-17]。以上多項實(shí)驗表明，VEGF-D的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期晚者VEGF-D陽性率越高，生存期越短。VEGF-D有望成為腫瘤淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)。

3.2　胃癌癌旁組織MLVD與生存期的關(guān)系

本研究顯示，癌旁組織MLVD高組較低組生存期短(P=0.001)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。我們既往研究胃癌組織、癌旁及正常組織MLVD的比較顯示，52例胃癌在以上3組MLVD表達(dá)情況為癌旁組織最高、胃癌組織最低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。癌旁組織的MLVD更能反映患者的預(yù)后。Rudno-Rudzinska等[9]認(rèn)為VEGF-D能指導(dǎo)進(jìn)展期胃癌的OS，胃癌組織LVD(lymphatic vessel density)及胃癌癌旁組織LVD對進(jìn)展期胃癌患者生存期有影響。

3.3　胃癌組織MLVD與生存期的關(guān)系

胃癌組織MLVD高組較低組生存期短(P=0.067)，兩者間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。我們既往研究胃癌VEGF-D表達(dá)和不同區(qū)域MLVD的關(guān)系顯示，VEGF-D陽性的癌旁組織中MLVD高于VEGF-D陰性者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而胃癌組織中兩者M(jìn)LVD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究顯示，胃癌組織VEGF-D陽性者生存期較陰性者明顯縮短。我們既往研究顯示，胃癌癌旁組織VEGF-D陽性者M(jìn)LVD顯著高于陰性者，可以認(rèn)為癌旁組織MLVD的升高可能受到VEGF-D刺激所致。而胃癌組織中VEGF-D陽性者M(jìn)LVD與陰性者差異不明顯。這種現(xiàn)象考慮與胃癌中心組織受壓明顯，脈管生長不正常有關(guān)。

3.4　VEGF-D及MLVD與胃癌預(yù)后的關(guān)系

目前進(jìn)展期胃癌的治療仍很困難。新化療藥物聯(lián)合分子靶向藥物的治療已進(jìn)入臨床，并成為非手術(shù)治療的主要手段?？沽馨凸苌傻乃幬飳?shí)驗仍處于實(shí)驗階段[18-19]。經(jīng)多年研究，人們證實(shí)了淋巴管生長因子促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生長的作用，明確了淋巴管生成的部分分子機(jī)制。VEGF-D/VEGF-C/VEGFR-3信號通路的發(fā)現(xiàn)奠定了腫瘤轉(zhuǎn)移的研究基礎(chǔ)。然而，腫瘤中新生淋巴管與原有淋巴管之間的關(guān)系，它們在腫瘤轉(zhuǎn)移中所起的作用，腫瘤轉(zhuǎn)移的具體過程和詳細(xì)機(jī)制，以及怎樣參與腫瘤淋巴管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移的信號通路和其他生長因子還有待進(jìn)一步研究。靶向治療藥物提高了部分化療耐藥腫瘤的療效。它們與化療、放療以及其他分子靶向藥物的聯(lián)合治療的療效，有望進(jìn)一步提高。今后將收集更多病例進(jìn)行生存與預(yù)后分析，還可以結(jié)合胃癌的其他腫瘤相關(guān)預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行研究，得出更為完整的結(jié)果。

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(編輯：吳小紅)

·臨床研究·

(編輯：吳小紅)

Relationship between Expression of VEGF-D and MLVD in Gastric

Cancer Tissues and Prognosis

DENGMingjia,SHENLida,ZHANGLijuan.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanTumorHospital,Kunming,650118

【Abstract】ObjectiveTo study the relationships between expression of vascular endothelial growth factor-D( VEGF-D) and micro-lymphatic vessel density(MLVD) of gastric cancer tissues and overall survival.Methods52 samples of resected gastric cancer were gathered.The expression of VEGF-D in gastric cancer,intratumoral MLVD and peritumoral MLVD were stained immunohistochemically.Clinical data and stastistical analysis were combined to find the relationship in VEGF-D,MLVD and overall survival.ResultsThe overall survival of VEGF-D positive group was significantly shorter than that of negative group (P=0.048).There was statistical difference between the 2 groups.The overall survival of peritumoral high MLVD group(≥10) was significantly shorter than that of low MLVD group(<10)(P=0.001).There was statistically difference between the 2 groups.But the overall survival of intratumoral high MLVD group(≥10) was not statistically shorter than low MLVD group(<10)(P=0.067).ConclusionThe detection of VEGF-D and peritumoral MLVD in the tissue of gastric cancer can be regarded as unfavorable prognostic indicator for patients with gastric cancer.

【Key words】Stomach neoplasms;Vascular endothelial growth factor-D( VEGF-D);Micro-lymphatic vessel density(MLVD);Immunohistochemistry;Prognosis;Survival time

中圖分類號：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)01-0039-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.012

通訊作者：沈麗達(dá)

收稿日期(2015-01-20修回日期 2015-04-29) (2015-02-04修回日期 2015-05-18)