銀杏葉提取物對(duì)阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能的效果及其對(duì)相關(guān)因子的影響

黃建申 沈英生 黃金武

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，莆田，351100)

銀杏葉提取物對(duì)阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能的效果及其對(duì)相關(guān)因子的影響

黃建申 沈英生 黃金武

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，莆田，351100)

目的：觀察銀杏葉提取物對(duì)阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能的改善效果以及探討其部分作用機(jī)制。方法：將本院2013年1月至2014年1月收治的80例阿爾茨海默病患者隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組各40例。2組患者均口服鹽酸多奈哌齊，1次/d，10 mg/次。在此基礎(chǔ)上觀察組患者加用銀杏葉提取物注射液，2組均連續(xù)治療3個(gè)月，分別比較2組患者治療前、治療1個(gè)月及治療3個(gè)月后簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(MMSE)、畫鐘試驗(yàn)積分(CDT)、日常生活能力積分(ADL)的變化，以及檢測(cè)2組患者治療前后外周血清cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路上標(biāo)志性蛋白cAMP、PKA及CREB濃度的變化。結(jié)果：1)2組患者治療前MMSE、CDT及ADL的積分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療1個(gè)月后2組患者M(jìn)MSE、CDT及ADL積分較治療前有所提升(P<0.05)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療3個(gè)月后2組患者M(jìn)MSE、CDT及ADL積分進(jìn)一步改善，其中觀察組改善的幅度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2)使用Elisa法檢測(cè)cAMP、PKA濃度，用Western blotting檢測(cè)CREB濃度，治療前2組患者cAMP、PKA、CREB蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療3個(gè)月后觀察組患者外周血清cAMP、PKA、CREB蛋白濃度均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：銀杏葉提取物可改善阿爾茨海默病患者認(rèn)知能力，其作用機(jī)制可能通過介導(dǎo)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路有關(guān)。

阿爾茨海默病；認(rèn)知功能；銀杏葉提取物；cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路

阿爾茨海默病是一種原因不明的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其導(dǎo)致患者對(duì)外界的感知能力遲鈍甚至錯(cuò)亂，嚴(yán)重影響患者日常生活能力，所產(chǎn)生的傷害遠(yuǎn)大于器質(zhì)性損傷[1-2]。根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，全球約有1 000萬阿爾茨海默病患者，年齡每增加5歲，患病率將增加2倍。因此改善阿爾茨海默病患者認(rèn)知能力是目前臨床刻不容緩的任務(wù)。

阿爾茨海默病屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”“善忘”等范疇，近年來我們對(duì)國內(nèi)外大量文獻(xiàn)進(jìn)行查閱，發(fā)現(xiàn)瘀血阻絡(luò)是阿爾茨海默病患者的主要病機(jī)類型，因此我們認(rèn)為活血化瘀是阿爾茨海默病患者的主要治則。銀杏葉提取物注射液具有明顯活血化瘀功能，可改善各類認(rèn)知功能障礙，這一結(jié)果被諸多文獻(xiàn)所證實(shí)，但其改善認(rèn)知功能的作用機(jī)制尚未明了。近年來研究顯示cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路其通過參與管理神經(jīng)元細(xì)胞的增殖凋亡，從而與神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和記憶能力關(guān)系密切，因此我們?cè)O(shè)想：銀杏葉提取物改善阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能是否通過cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路進(jìn)行橋接？因此本團(tuán)隊(duì)進(jìn)行一系列臨床觀察研究，為目前熱門的臨床診療提供切實(shí)可行的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本院2014年1月至2015年1月收治的80例阿爾茨海默病患者納入研究，所有入組患者均符合2001年中華醫(yī)學(xué)精神科分會(huì)頒布的《中國精神障礙分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于阿爾茨海默病的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。80例患者隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組各40例，2組患者在年齡、性別、病程等一般情況方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)年齡≥60歲；2)患者有記憶力減退、注意力不集中、行為紊亂、睡眠障礙等癥狀；3)近30 d未服用改善認(rèn)知藥物；4)患者或家屬簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)年齡<60歲；2)有肝腎等重大臟器病變或合并腫瘤；3)全身性疾病等其他引發(fā)癡呆；4)患者或家屬不予前述知情同意書者。

1.4 治療方法 2組患者均口服鹽酸多奈哌齊(安理申，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050978)，1次/d，10 mg/次，觀察組在此基礎(chǔ)上加用銀杏葉提取物注射液(金納多，臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠股份有限公司，國藥準(zhǔn)字HC20140019，5 mL/支)，5 mL銀杏葉提取物注射液+250 mL 0.9%氯化鈉溶液，靜脈滴注，1次/d。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(MMSE)量表評(píng)分[11]該量表包括時(shí)間、空間定向力、遲記憶力、注意力及計(jì)算力，語言表達(dá)力等，總分為30分，<23分為認(rèn)知功能缺陷。

1.5.2 畫鐘試驗(yàn) 要求患者在白紙上獨(dú)立畫出一個(gè)鐘，并標(biāo)出指定的8:25或9:10的位置，并且要求患者在10 min內(nèi)完成。畫鐘試驗(yàn)積分(CDT)規(guī)定如下：畫出閉鎖圓圈得1分；將數(shù)字安放在表盤上正確位置得1分；表盤數(shù)字順序正確得1分；指針位置安放正確得1分。

1.5.3 日常生活能力評(píng)分 日常生活能力積分(ADL)共有14項(xiàng)，包括2部分內(nèi)容：1)軀體生活自理量表，共6項(xiàng)：如側(cè)、進(jìn)食、穿衣、梳洗、行走和洗澡；2)工具性日常生活能力量表，共8項(xiàng)：打電話、購物、備餐、做家務(wù)、洗衣、使用交通工具、服藥和自理經(jīng)濟(jì)。

1.5.4 ELISA檢測(cè)cAMP、PKA表達(dá)水平 1)采取患者肘靜脈血4 mL，制備血清標(biāo)本，充分分解，然后加樣、稀釋標(biāo)本置于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品，再加入IL-8抗體；2)溫育洗滌后加入親和鏈酶素-HRP，混勻溫育30 min；3)洗滌4次后每孔加入底物A、B各50 μL混勻，37 ℃溫育10 min，避免光照；4)取出酶標(biāo)板，立即加入50 μL終止液測(cè)定結(jié)果。

1.5.5 Western blotting檢測(cè)CREB濃度 將外周血加入淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單核細(xì)胞，利用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將提取的細(xì)胞置于置于37 ℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4～6 h，隨后以3 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集細(xì)胞，然后加入細(xì)胞裂解液，充分裂解后置于4 ℃，12 000 r/min離心機(jī)離心10 min。取上清液獲取總蛋白，再根據(jù)DAB方法對(duì)所提蛋白液進(jìn)行濃度測(cè)定，之后以100 μL蛋白液中加入25 μL的上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中變性，接著可按照每泳道上樣量為50 μg蛋白，計(jì)算上樣量，電泳(4%濃縮膠，12%分離膠，120 V，50 mA，1.5 h)結(jié)束后將凝膠取出，用PVDF膜轉(zhuǎn)印，遵循膠在負(fù)極，膜在正極的原則，50 V，100 mA，2 h，5%脫脂奶粉液的封閉2 h，TBS洗3次，每次5 min，分別加入5%脫脂奶粉按1∶1 000稀釋的抗CREB和β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBS洗3次，每次5 min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫2 h，TBS洗3次，每次5 min。將濾膜放人配好的顯色液中顯色15～30 min，計(jì)算機(jī)掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)Bio-Rad公司,Model Gel Doc 2000,美國)，分析處理。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉提取物注射液可提高患者的認(rèn)知能力及日常生活能力 2組患者治療前MMSE、CDT及ADL的積分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療1個(gè)月后2組患者M(jìn)MSE、CDT及ADL積分較治療前有所提升(P<0.05)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療3個(gè)月后2組患者M(jìn)MSE、CDT及ADL積分進(jìn)一步改善，其中觀察組改善的幅度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組患者一般資料比較

表2 2組MMSE評(píng)分比較，分)

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時(shí)期對(duì)照組比較P<0.05；▲表示與同組治療后1個(gè)月比較P<0.05。

表3 2組CDT評(píng)分比較，分)

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時(shí)期對(duì)照組比較P<0.05；▲表示與同組治療后1個(gè)月比較P<0.05。

表4 2組ADL評(píng)分比較，分)

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時(shí)期對(duì)照組比較P<0.05；▲表示與同組治療后1個(gè)月比較P<0.05。

2.2 銀杏葉提取物注射液可提高阿爾茨海默病患者外周血cAMP、PKA、CREB的濃度 使用Elisa法檢測(cè)cAMP、PKA濃度，用Western blotting檢測(cè)CREB濃度，治療前2組患者cAMP、PKA、CREB蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療3個(gè)月后觀察組患者外周血清cAMP、PKA、CREB蛋白濃度均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 2組治療前后cAMP及PKA濃度比較

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時(shí)期對(duì)照組比較P<0.05。

圖1 2組治療前后CREB蛋白結(jié)果比較

3 討論

在我國經(jīng)濟(jì)水平不斷發(fā)展的同時(shí)人口老齡化亦日趨嚴(yán)重，年齡的不斷增長致使機(jī)體自身功能水平不斷下降，增加了患病的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿爾茨海默病的發(fā)生與腦組織彌漫性萎縮性改變從而導(dǎo)致老年患者出現(xiàn)智能障礙[4-6]。目前醫(yī)學(xué)仍將阿爾茨海默病界定為無法痊愈的疾病，患者雖然接受改善腦循環(huán)、營養(yǎng)腦神經(jīng)等治療，但臨床效果抑制差強(qiáng)人意[7-9]。近年來中草藥以療效顯著、安全性高等特點(diǎn)被諸多臨床工作者所認(rèn)可。在多年的臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物注射液對(duì)改善認(rèn)知功能障礙患者的認(rèn)知能力方面有明顯的效果，隨著阿爾茨海默病患者發(fā)病率的逐年增加，我們對(duì)銀杏葉提取物注射液治療阿爾茨海默病患者的療效進(jìn)行了觀察總結(jié)，結(jié)果顯示銀杏葉提取物注射液可明顯提高阿爾茨海默病患者的MMSE、CDT及ADL評(píng)分，這說明該藥物可改善認(rèn)知能力，從而提高患者的日常生活能力，在研究中我們發(fā)現(xiàn)，治療1個(gè)月時(shí)2組患者組間認(rèn)知能力及日常生活能力相仿，直至治療3個(gè)月后組間上述指標(biāo)差異才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此我們認(rèn)為銀杏葉提取物注射液的確可明顯改善阿爾茨海默病患者的認(rèn)知能力，但其具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。

阿爾茨海默病屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”“善忘”等范疇，《醫(yī)學(xué)震中參西錄》中提到：“腦髓純者靈，雜者鈍”，故本病病位在腦。唐容川在《中西匯通醫(yī)書種》一書中寫到：“血在上，則濁蔽而不明矣，凡有瘀者，亦令健忘”。且在查閱大量臨床文獻(xiàn)及隨訪大量臨床患者，我們亦認(rèn)為瘀血阻滯是阿爾茨海默病的主要證型，機(jī)體十二經(jīng)脈，三百余絡(luò)，其血皆上于面而走空竅，此空竅即腦髓，故氣血通順濡養(yǎng)腦竅是發(fā)揮理想技能的基礎(chǔ)。老年患者氣血虧虛致瘀，清代王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》一書中寫到“氣血凝滯，腦氣與臟腑不通，如夢(mèng)，如呆”，因此，氣虛血滯，氣血無法上注于清竅，腦髓失養(yǎng)，病程日久者出現(xiàn)善忘、癡呆等智能減退癥狀，因此，活血化瘀是調(diào)和血脈，清竅得養(yǎng)的關(guān)鍵[10-13]。銀杏葉是傳統(tǒng)的活血化瘀藥，傳統(tǒng)藥理學(xué)認(rèn)為銀杏葉提取物注射液可選擇性擴(kuò)張腦血管，從而增加腦組織血氧含量，改善患者血液流變學(xué)，從而改善循環(huán)，最終實(shí)現(xiàn)改善腦功能的目的，但是隨著臨床研究的不斷深入，我們?cè)谂R床上發(fā)現(xiàn)，有部分阿爾茨海默病患者使用銀杏葉提取物注射液治療后認(rèn)知功能有明顯的提升，但其血液流變學(xué)與治療前相比并無明顯變化，因此，我們認(rèn)為銀杏葉提取物注射液介導(dǎo)阿爾茨海默病患者的功能改善機(jī)制可能存在多靶點(diǎn)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)[14-15]對(duì)認(rèn)知能力研究逐漸發(fā)展至分子生物學(xué)水平，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路與認(rèn)知功能具有密切關(guān)系，通過解剖實(shí)驗(yàn)大鼠發(fā)現(xiàn)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的標(biāo)志性蛋白在海馬組織有廣泛的分布，而海馬是與記憶關(guān)系密切的腦組織結(jié)構(gòu)。cAMP是細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，將激素或神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)致靶細(xì)胞后通過磷酸化靶酶，從而參與基因的開啟表達(dá)、細(xì)胞的增殖、代謝及凋亡。PKA是神經(jīng)元細(xì)胞重塑的主要物質(zhì)，具有催化活性作用的PKA在保持長時(shí)程記憶環(huán)節(jié)有重要作用。使細(xì)胞膜上G蛋白的偶聯(lián)受體與細(xì)胞內(nèi)的配體相結(jié)合而活化，從而使cAMP濃度增加，活性及濃度增強(qiáng)的cAMP與具有催化活性的PKA相結(jié)合，出現(xiàn)核移位而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)磷酸化下游重要因子CREB，從而開啟了下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。CREB是機(jī)體多條重要信號(hào)通路的共同作用點(diǎn)，對(duì)記憶、學(xué)習(xí)以及各類情緒變化均具有重要的維持及調(diào)節(jié)作用。諸多動(dòng)物研究顯示抑制大鼠海馬cAMP-PKA-CREB的表達(dá)，大鼠的記憶力出現(xiàn)明顯下降。在本研究中我們對(duì)2組患者治療前后外周血清的cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的標(biāo)志性蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示2組患者經(jīng)過治療干預(yù)后cAMP、PKA、CREB蛋白的濃度均出現(xiàn)上調(diào)，其中觀察組上調(diào)的幅度較對(duì)照組明顯，這一結(jié)果提示銀杏葉提取物注射液可改善阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能的作用機(jī)制可能與提高cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

總之，杏葉提取物注射液治療阿爾茨海默病患者具有明顯的醫(yī)療價(jià)值，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

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(2016-09-13收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Ginkgo biloba extract on Cognitive Function of Senile Dementia Patients and Its Effect on Related Factors

Huang Jianshen,Shen Yingwu,Huang Jinwu

(FuzhouGeneralHospitalFirstAffiliatedHospitalofNanjingMilitaryRegion,Putian351100,China)

Objective:To observe the improvement effect of the ginkgo biloba extract on the cognitive function in the patients with senile dementia, and discuse its mechanism. Methods:A total of 80 senile dementia patients in our hospital during in January 2013-January 2014 were randomly divided into control group and observation group, 40 cases in each group. Both of the two groups orally took Donepezil HCL, once a day, 10 mg/time. The observation group additionally had ginkgo biloba extract injection on these basis, both two group had continuous treatment for 3 months and then compare the two groups′mini-mental state examination(MMSE), clock drawing task (CDT), activity of daily living (ADL) before treatment, and 1 month and 3 months after treatment, as well as detect two groups′concentration changes of iconic proteins cAMP, PKA and CREB in patients with peripheral serum cAMP-PKA-CREB signaling pathways before and after treatment. Results:1) Integral differences of MMSE, CDT and ADL were showed no statistical significance in the two groups after the treatment (P>0.05), the MMSE, CDT and ADL integral rose after 1 month′s treatment in the two groups (P<0.05), but there was no statistically significant differences between the two groups (P>0.05); and 3 months after treatment, MMSE, CDT, ADL integral of the two groups further improved, which the improvement extent of observation group was significantly higher than the control group, the differences were statistically significant (P<0.05). 2)The cAMP, PKA concentration detected by Elisa method, and CREB concentration by Western blotting test showed no statistically significant differences between the two groups (P>0.05), but 3 months after treatment, cAMP, PKA, and CREB protein concentrations in peripheral blood in the treatment group were significantly higher than that of control group (P<0.05). Conclusion:Ginkgo biloba extract can improve the cognitive ability in patients with senile dementia, the mechanism may be related to cAMP-PKA-CREB signaling pathways.

Senile dementia; Cognitive function; Ginkgo biloba extract; cAMP-PKA-CREB signaling pathways

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào)：30600795)

黃建申(1982.09—)，男，大學(xué)本科，醫(yī)師，研究方向：腦血管疾病，E-mail：178419573@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.028