春石斛類原球莖克隆增殖技術(shù)研究

朱志國

蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝學(xué)院，安徽蕪湖，241003

春石斛類原球莖克隆增殖技術(shù)研究

朱志國

蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝學(xué)院，安徽蕪湖，241003

以春石斛(Dendrobiumnobile)莖尖誘導(dǎo)的無菌類原球莖作為外植體，在2/1 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA和6-BA，采用不同的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)時(shí)間，設(shè)置不同的pH值等，對(duì)春石斛類原球莖克隆增殖技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)探討。結(jié)果顯示，采用1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基配方對(duì)春石斛類原球莖克隆增殖效果最好。不同培養(yǎng)方式之間春石斛類原球莖增殖系數(shù)差異明顯，液體培養(yǎng)較固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)效果好；液體培養(yǎng)中以液體振蕩培養(yǎng)，同時(shí)添加活性炭為最佳。試驗(yàn)還表明，春石斛類原球莖的增殖率與培養(yǎng)時(shí)間成一定線性相關(guān)。經(jīng)液體培養(yǎng)20 d，春石斛類原球莖數(shù)量增殖多，且沒有明顯的褐化現(xiàn)象，其中培養(yǎng)基pH值設(shè)為5.5最適宜。

春石斛；類原球莖；增殖

春石斛(Dendrobiumnobile)屬蘭科附生蘭，是花卉中名貴的花卉之一[1-2]，由于在春季開花，故名春石斛。春石斛一般采用類原球莖繁殖新個(gè)體，但增殖率低[3-4]，學(xué)界對(duì)類原球莖培育形成后如何克隆增殖的探討報(bào)道不多，采用液體培養(yǎng)進(jìn)行克隆增殖的相關(guān)研究很少。本試驗(yàn)采用春石斛培育形成的類原球莖為主要試材，研究植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類及其濃度、培養(yǎng)方式等對(duì)春石斛克隆的效果，以探討春石斛類原球莖克隆增殖的最佳途徑，為規(guī)?；a(chǎn)春石斛優(yōu)良種苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以分離的春石斛莖尖作為外植體培育形成的類原球莖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同激素組合對(duì)春石斛類原球莖克隆增殖的影響

基本培養(yǎng)基為1/2 MS，NAA濃度設(shè)0、0.5、1.0、2.0 mg·L-1，分別添加6-BA 0.5、1.0 mg·L-1和KT 0.05、0.10、0.20、0.50 mg·L-1。每處理接種10瓶，每瓶接種15塊類原球莖。

以上材料培養(yǎng)45 d后進(jìn)行克隆系數(shù)統(tǒng)計(jì)，以類原球莖增殖總數(shù)/接種類原球莖數(shù)計(jì)算[5-6]。

1.2.2 培養(yǎng)方式對(duì)春石斛類原球莖克隆增殖的影響

1.2.2.1 液體、半固體、固體培養(yǎng)方式比較

把誘導(dǎo)形成的類原球莖分別接種于添加7.0 g、3.5 g瓊脂的培養(yǎng)基和不添加瓊脂的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每處理接種10瓶，每一瓶大約接種2.0 g類原球莖。

以上材料培養(yǎng)20 d后進(jìn)行克隆系數(shù)統(tǒng)計(jì)，以類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球莖重量計(jì)算。

1.2.2.2 液體振蕩、液體靜置、添加活性炭、不添加活性炭比較

將誘導(dǎo)形成的春石斛類原球莖分別進(jìn)行振蕩、靜置培養(yǎng)、加入活性炭液體振蕩培養(yǎng)和加入活性炭液體靜置培養(yǎng)4種處理。培養(yǎng)基成分為1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1。每處理接種10瓶，每一瓶接種大約2.0g類原球莖。

以上材料培養(yǎng)20 d后進(jìn)行克隆系數(shù)統(tǒng)計(jì)，以類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球重量計(jì)算。

1.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

將春石斛類原球莖接種于液體培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1，添加活性炭振蕩培養(yǎng)。一共接種10瓶，每一瓶約接種2.0 g類原球莖，分別培養(yǎng)10、20、30 d后統(tǒng)計(jì)類原球莖重量，以類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球莖重量計(jì)算。

1.2.4 培養(yǎng)基pH值對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

培養(yǎng)基滅菌前，pH值分別設(shè)為5.0、5.5、6.0、6.5，添加活性炭液體振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理10瓶，每瓶約2.0 g原球莖，14 d后統(tǒng)計(jì)類原球莖重量，計(jì)算克隆系數(shù)，以接種類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球莖重量。

各處理均采用不添加瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基(激素組合和培養(yǎng)方式處理除外)，添加6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1(激素處理除外)、3%的蔗糖、1.0 g·L-1活性炭(不同培養(yǎng)方式處理除外)。培養(yǎng)基pH調(diào)至5.5～6.0(pH值對(duì)照組除外)，各處理培養(yǎng)溫度設(shè)為(25±2)℃，光照時(shí)間14 h/d，光照強(qiáng)度40 μmol·s-1。采取Microsoft Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，多重對(duì)照用Duncan檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素組合對(duì)春石斛類原球莖克隆誘導(dǎo)的影響

激素配比對(duì)春石斛類原球莖克隆增殖的效果影響顯著。表1表明，3號(hào)處理的春石斛類原球莖克隆系數(shù)最高，1號(hào)處理次之，22號(hào)最低。其中，6-BA比KT的克隆效果好；當(dāng)KT濃度大于0.1 mg·L-1時(shí)，春石斛類原球莖克隆系數(shù)明顯下降。當(dāng)6-BA為0.5 mg·L-1時(shí)，NAA濃度控制在0～1.0 mg·L-1范圍內(nèi)效果較好。類原球莖經(jīng)20 d培養(yǎng)后，表面出現(xiàn)新的不規(guī)則狀凸起，進(jìn)而發(fā)育形成新的類原球莖，實(shí)現(xiàn)了克隆增殖的目標(biāo)。而原來的類原球莖則形成春石斛新個(gè)體。類原球莖克隆時(shí)切割不易過碎，不然會(huì)導(dǎo)致褐化壞死。另外，在培養(yǎng)基中添加適量活性炭對(duì)防止褐化有一定效果。

表1 不同激素組合對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

注：不同字母代表在0.05水平差異顯著。以下各表同。

2.2 培養(yǎng)方式對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

2.2.1 液體、半固體、固體培養(yǎng)對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

由表2可知，春石斛類原球莖采用液體、半固體、固體等方式進(jìn)行培養(yǎng)，其克隆效果差異顯著。在不添加任何瓊脂的4種激素組合的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)形成類原球莖的時(shí)間均較短，形成的類原球莖數(shù)量多，類原球莖克隆系數(shù)大，最大可達(dá)4.21；培養(yǎng)基較硬的固體培養(yǎng)最差，克隆系數(shù)只有2.27，且質(zhì)地硬，表面發(fā)綠；而介于液體與固體之間的半固體培養(yǎng)次之，但增殖狀況明顯比液體培養(yǎng)差。在液體培養(yǎng)的4種激素組合中，春石斛類原球莖克隆效果差異不顯著，但半固體誘導(dǎo)的類原球莖發(fā)育不夠健壯，顏色呈淡黃綠，有玻璃化現(xiàn)象，類原球莖質(zhì)地也較硬。因此，在春石斛類原球莖克隆增殖過程中，采取液相和固相結(jié)合的方式進(jìn)行培養(yǎng)較好，即先把外植體接種于不添加瓊脂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，再轉(zhuǎn)接到添加瓊脂的培養(yǎng)基接著培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成的類原球莖質(zhì)量好，且培養(yǎng)周期短。

表2 液體、半固體、固體培養(yǎng)對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

2.2.2 液體靜置、液體振蕩培養(yǎng)對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

液體靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響如表3所示。液體振蕩培養(yǎng)的增殖系數(shù)為1.82，數(shù)量多，晶瑩飽滿；而液體靜置培養(yǎng)只有0.73，且形成的類原球莖數(shù)量少，個(gè)小干癟，故液體振蕩培養(yǎng)比液體靜置培養(yǎng)明顯要好。添加活性炭可以吸附原球莖表面的褐化物質(zhì)，一定程度上可增加原球莖數(shù)量，同時(shí)改變?cè)蚯o的質(zhì)地，使原球莖更硬、更綠。

表3 液體靜置、振蕩培養(yǎng)

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)春石斛克隆的影響見表4。由表4可知，春石斛類原球莖克隆系數(shù)與液體培養(yǎng)時(shí)間成一定的線性相關(guān)。經(jīng)過20 d培養(yǎng)后，春石斛類原球莖數(shù)量不斷增加，原球莖色澤呈黃綠，有少數(shù)原球莖褐化，晶瑩飽滿；但培養(yǎng)30 d后，春石斛類原球莖色澤泛黃，褐化程度越來越嚴(yán)重。因此，春石斛培養(yǎng)的時(shí)間不易太長，培養(yǎng)20 d較好，不僅能保證形成一定數(shù)量的類原球莖，還能避免褐化現(xiàn)象。

2.4 pH值對(duì)春石斛類原球莖克隆增殖的影響

pH值對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響如表5所示。由表5可知，采取液體振蕩培養(yǎng)，pH值調(diào)節(jié)至5.5時(shí)，克隆增殖效果最佳，數(shù)量多，個(gè)體體積大；其次是pH值為6.0時(shí)，春石斛原球莖克隆數(shù)量多，但個(gè)體體積小；當(dāng)pH值設(shè)為5.0時(shí)，效果最差，增殖系數(shù)只有1.31，產(chǎn)生的原球莖數(shù)量少，且個(gè)體體積小。

表4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)春石斛類原球莖克隆的影響

表5 pH值對(duì)春石斛類原球莖增殖的影響

3 結(jié)論與討論

石斛蘭組織培養(yǎng)技術(shù)早在20世紀(jì)60年代初國外就有不少研究[7-8]，并取得了一定的成效，不少品種還建立了快速繁殖體系。國內(nèi)學(xué)界對(duì)春石斛的研究起步較晚，目前花卉市場(chǎng)上的春石斛大多數(shù)是引進(jìn)日本等國的二、三代種苗[9-10]，經(jīng)部分生產(chǎn)者通過多年的引種試種經(jīng)驗(yàn)，選育出了一些適合我國栽培的優(yōu)良品種，石斛蘭正作為一種產(chǎn)業(yè)在迅速發(fā)展。

不同品種的春石斛，其克隆增殖最適基本培養(yǎng)基不同，雖然1/2 MS、MS、M及VW等均可用于原球莖克隆增殖，但不同培養(yǎng)基增殖速度不同、品質(zhì)差異很大，大多數(shù)研究選用MS作為基本培養(yǎng)基[11-12]，本試驗(yàn)采用1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，克隆效果較好。培養(yǎng)過程中，在添加不同的植物生長激素并改變激素濃度的情況下，春石斛類原球莖克隆增殖效果差異顯著。其中，采用NAA 1.00 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1組合，春石斛類原球莖克隆增殖效果最佳；KT沒有6-BA效果好；KT濃度大于0.1 mg·L-1，春石斛克隆增殖系數(shù)顯著下降；當(dāng)6-BA 0.5 mg·L-1，NAA濃度控制在0～1.00 mg·L-1范圍內(nèi)，效果較好。液體振蕩明顯比固體、半固體培養(yǎng)克隆增殖系數(shù)大，可能是因?yàn)橐后w培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基通氣性好，而且液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，類原球莖與培養(yǎng)基接觸面大，吸收營養(yǎng)成分充足[13]。春石斛類原球莖克隆增殖系數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間成一定的線性相關(guān)，經(jīng)過20 d培養(yǎng)后，原球莖數(shù)量不斷增大，褐化也變得嚴(yán)重，因此，誘導(dǎo)克隆培養(yǎng)時(shí)間不能太長，20 d即可，既能產(chǎn)生一定數(shù)量的原球莖新個(gè)體，又可克服褐化、污染等現(xiàn)象。同時(shí)，原球莖培養(yǎng)可以采用固相與液相相結(jié)合的培養(yǎng)方式培養(yǎng)[14-15]，即原球莖誘導(dǎo)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而原球莖增殖采用液體振蕩培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法不僅能保證原球莖的重量，而且能保證原球莖增殖的速度。不同的pH值對(duì)春石斛克隆增殖的影響也不同，采用液體振蕩培養(yǎng)，pH值調(diào)節(jié)至5.5時(shí)，克隆增殖效果最佳，數(shù)量多，個(gè)體體積大。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.08.034

2016-04-15

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目基金(KJ2015A425)；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目基金(KJ2012B219)；蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目基金(Wzykj2016A02)。

朱志國(1976-)，安徽肥西人，碩士，教授，主要研究方向：觀賞植物繁育與栽培。

S567.239

A

1673-2006(2016)08-0124-04