1株解淀粉芽孢桿菌HN011抑菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的分析

張龍來(lái)， 康向輝， 魏孝義， 徐漢虹

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 廣東 510642；2 中國(guó)科學(xué)院 華南植物園/植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 廣東 510650)

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1株解淀粉芽孢桿菌HN011抑菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的分析

張龍來(lái)1， 康向輝1， 魏孝義2， 徐漢虹1

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 廣東 510642；2 中國(guó)科學(xué)院 華南植物園/植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 廣東 510650)

摘要：【目的】分離和鑒定生防菌HN011在 YPD條件下發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物?！痉椒ā縃N011少量 (1 L) 發(fā)酵，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行液-液萃取，通過(guò)金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的活性試驗(yàn)跟蹤確定活性部位;通過(guò)放大發(fā)酵，對(duì)活性部位進(jìn)行分離得到單體化合物。利用核磁共振和質(zhì)譜等手段，鑒定單體化合物?！窘Y(jié)果】生防菌HN011少量發(fā)酵后，發(fā)酵液經(jīng)不同極性的有機(jī)溶劑液-液萃取，萃取物的活性試驗(yàn)表明，乙酸乙酯部位活性最強(qiáng)，其次氯仿部位，正丁醇部位活性較弱，石油醚部位、水部位活性不明顯。通過(guò)放大發(fā)酵，在活性部位分離出15個(gè)單體，結(jié)構(gòu)鑒定表明，主要為小分子的環(huán)二肽?！窘Y(jié)論】生防菌HN011在YPD的發(fā)酵條件下，次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為一些小分子的環(huán)二肽。

關(guān)鍵詞：生物農(nóng)藥； 生防菌； 解淀粉芽孢桿菌； 次級(jí)代謝產(chǎn)物； 環(huán)二肽

解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens是目前生防細(xì)菌中研究較多的一類(lèi)，因其能夠產(chǎn)生具有耐熱、耐旱、抗紫外線(xiàn)和有機(jī)溶劑功能的內(nèi)生孢子,是篩選生防菌比較理想的對(duì)象[1-2]。解淀粉芽孢桿菌抑菌范圍很廣，主要包括根部病害、葉部病害和收獲后果品病害，如大豆根腐病、番茄青枯病、蘋(píng)果紅腐病、小麥赤霉病及其他一些土傳和地上部病害等[3-4]。在這些抗菌化合物中，環(huán)狀脂肽如表面活性素(Surfactins)、伊枯草菌素(Iturins)和豐原素(Fengycins或Plipastatins)具有非常顯著的抑制各種微生物的活性。它們的靶標(biāo)都是在細(xì)胞質(zhì)膜上[5]。本文研究的解淀粉芽孢桿菌HN011菌株是一種生防菌，對(duì)多種病原真菌均有明顯的拮抗作用。平板對(duì)峙試驗(yàn)和生長(zhǎng)速率試驗(yàn)表明，HN011菌株對(duì)香蕉枯萎病病原菌、番茄頸腐根腐病病原菌、菜心炭疽病病原菌、水稻稻瘟病菌、水稻紋枯病菌有明顯的抑菌效果；濾紙片法試驗(yàn)表明，HN011發(fā)酵液對(duì)水稻白葉枯病菌、金黃色葡萄球菌也有明顯的抑菌現(xiàn)象[6]。對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物鮮見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究，旨在為下一步提高其生物防治效果提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株生防菌：解淀粉芽孢桿菌HN011；病原菌：金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus。均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2供試試劑石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、甲醇等，均為廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)生產(chǎn)的分析純；氘代二甲基亞砜和氘代甲醇，均為美國(guó)劍橋公司(CIL)產(chǎn)品；YPD培養(yǎng)基: 酵母粉5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨20 g，葡萄糖12.5 g，蒸餾水1 L；柱層析硅膠為青島海洋化工廠(chǎng)產(chǎn)品(100～200目，200～300目)；反相硅膠層析為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品。

1.1.3供試儀器HEV-50型滅菌器，Hirayama公司；1702-MP8型電子天平，德國(guó)Startorius公司生產(chǎn)；SHIMADU LC-6AD/RID-10A(示差檢測(cè)器)(日本Shimadzu公司生產(chǎn))；色譜柱為XTerra Prep MS C18 Column (19 mm×300 mm×10 μm和4.6 mm×250 mm×10 μm)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀型號(hào)為EYELA N-1001；EYELA，A-1000S型循環(huán)水真空泵；EYELA CA-1111型低溫冷卻液循環(huán)泵，Tokyo Rikakai Co. Ltd.生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；MDS SCIEX API 2000LC/MS/MS 質(zhì)譜儀，美國(guó)Applied Biosystems 公司生產(chǎn)；BRUKER AV 600 M核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1活性部位初探將供試生防菌株HN011在YPD培養(yǎng)基上活化后，挑取1環(huán)接種于含25 mL YPD培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28 ℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，取5 mL種子液接種于1 L的YPD培養(yǎng)液中，28 ℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，得到發(fā)酵液。冷凍離心去除菌體后，利用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分步液-液萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏。利用牛津杯法對(duì)各個(gè)萃取部位浸膏進(jìn)行金黃色葡萄球菌抑制活性試驗(yàn)，確定活性部位。在相同條件下進(jìn)行放大發(fā)酵(53 L)培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后，除去菌體，分步萃取，得乙酸乙酯浸膏30.6 g，備用。

1.2.2活性部位大柱分段將活性部位浸膏，利用正相硅膠色譜分離方法，氯仿-甲醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)主點(diǎn)，分成若干個(gè)餾分段，對(duì)各餾分段進(jìn)行取樣,利用牛津杯法進(jìn)行金黃色葡萄球菌抑制活性試驗(yàn)，確定各餾分段的活性。

1.2.3各餾分的細(xì)分將活性餾分段通過(guò)ODS反相中壓色譜分離方法進(jìn)行細(xì)分，結(jié)合凝膠柱色譜和高效液相色譜分離方法，分離出活性餾分段的單體化合物。同時(shí)，為了更好地闡述生防菌HN011的次級(jí)代謝產(chǎn)物，活性較弱的餾分段利用各種分離技術(shù)，分離單體化合物。

1.2.4單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定各個(gè)餾分段分離出的單體化合物通過(guò)核磁共振波譜儀和質(zhì)譜儀等波譜方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2結(jié)果

2.1活性部位初探的結(jié)果

1 L的生防菌HN011發(fā)酵液通過(guò)冷凍離心去除菌體，分別用等比例不同極性的有機(jī)溶劑萃取3次，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑得石油醚部位浸膏0.41 g、氯仿部位浸膏0.22 g、乙酸乙酯部位浸膏0.42 g、正丁醇部位浸膏1.10 g。各部位的金黃色葡萄球菌抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯部位的抑菌圈最大，其次是氯仿部位、石油醚部位、正丁醇部位，水部位基本沒(méi)有活性(圖1)。考慮到乙酸乙酯部位和氯仿部位都具有活性，并且氯仿和乙酸乙酯的化學(xué)極性相差不大，放大發(fā)酵后，去除菌體的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)石油醚萃取后，直接使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，余下水部位，3個(gè)組分的金黃色葡萄球菌抑制試驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，石油醚部位和水部位抑菌圈較小，而乙酸乙酯部位抑菌圈較大，和預(yù)期的結(jié)果一致，生防菌HN011的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物都可以被乙酸乙酯萃取出來(lái)。

圖1少量發(fā)酵液萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制活性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.1The inhibitory activities of zymotic fluid extracts againstStaphylococcusaureusby a small amount of fermentation

圖2　放大發(fā)酵萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制活性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.2The inhibitory activities of zymotic fluid extracts against Staphylococcus aureus after amplifying fermentation

2.2活性部位大柱分段結(jié)果

利用正相硅膠色譜分離技術(shù)將30.6 g乙酸乙酯部位浸膏進(jìn)行分段。30 g正相硅膠拌樣后，采用φ為100%氯仿濕法裝柱干法上樣的方法，氯仿-甲醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)柱體積2 000 mL，以500 mL為1個(gè)小餾分，每個(gè)梯度洗脫3～4個(gè)柱體積。TLC色譜方法分析各個(gè)小餾分后，根據(jù)主點(diǎn)合并得10個(gè)餾分段。利用牛津杯法，對(duì)各餾分進(jìn)行金黃色葡萄球菌抑制活性試驗(yàn)，結(jié)果(圖3)表明，餾分E7的活性最明顯，餾分E6次之，E3和E8較弱，其他的餾分活性不明顯。

圖3　乙酸乙酯部位各餾分段金黃色葡萄球菌抑制活性

Fig.3The inhibitory activity of each fraction of ethyl acetate portion against Staphylococcus aureus

2.3各組分細(xì)分單體的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

將活性餾分段E7(4.0 g)通過(guò)ODS反相中壓色譜分離技術(shù)進(jìn)行分離，得到12個(gè)小組分，其中小組分4、6、7、8有明顯的主點(diǎn)。通過(guò)HPLC結(jié)合凝膠柱色譜分離技術(shù)對(duì)4個(gè)小組分進(jìn)行分離，得到單體化合物E7-4、E7-6、E7-7、E7-8。通過(guò)核磁共振氫譜和核磁共振碳譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，并用質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證，參考和比對(duì)文獻(xiàn)，鑒定化合物E7-4 為Cyclic(Thr-Leu)，E7-6為Cyclic(Tyr-Val)，E7-7為Cyclic(Tyr-Trp)(圖4a)。

將活性餾分段E6(2.6 g)通過(guò)ODS反相中壓色譜進(jìn)行分離，得到14個(gè)小組分，其中小組分4、5、13有明顯的主點(diǎn)，通過(guò)HPLC分析，發(fā)現(xiàn)E6的13個(gè)小組分和E7-8出峰時(shí)間一致，利用薄層色譜技術(shù)進(jìn)行比對(duì)，Rf一致，證明E6-13就是Cyclic(Phe-Tyr)。小組分4、5通過(guò)制備液相得到化合物E6-4和E6-5，利用核磁共振氫譜和核磁共振碳譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，并用質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證，參考和比對(duì)文獻(xiàn)，鑒定化合物E6-4為Cyclic(Phe-Gly)，E6-5為Cyclic(Phe-Ala)(圖4b)。

通過(guò)ODS反相中壓色譜進(jìn)行分離得若干個(gè)小組分，根據(jù)TLC判斷主點(diǎn)明顯的小組分進(jìn)行分離，結(jié)合凝膠色譜分離技術(shù)、高效液相色譜和制備液相色譜分離技術(shù)，分離得到單體。通過(guò)核磁共振氫譜和核磁共振碳譜，并用質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證，參考和比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定相關(guān)的化合物。從餾分段E3(2.2 g)分離出化合物E3-23;餾分段E8(1.4 g)分離出化合物E8-6B(圖4c);餾分段E4(7.4 g) 分離出化合物E4-2A、E4-3A、E4-10A、E4-10B(圖5a)；餾分段E5(6.1 g) 分離出化合物E5-4A、E5-4B、E5-4C(圖5b)。

圖4　活性餾分段分離出的化合物

圖5　活性不明顯餾分段分離出的化合物

化合物E7-4：白色粉末(甲醇)，1H NMR (600 MHz, DMSO)δ8.18 (d,J=2.5 Hz, 1H), 7.99 (d,J=2.7 Hz, 1H), 5.00 (d,J=5.5 Hz, 1H), 4.04～3.92 (m, 1H), 3.67～3.61 (m, 1H), 3.49 (t,J=2.6 Hz, 1H), 1.80 (dq,J=13.1, 6.6 Hz, 1H), 1.69 (ddd,J=14.1, 9.3, 5.0 Hz, 1H), 1.58 (ddd,J=13.6, 9.3, 4.6 Hz, 1H), 1.08 (d,J=6.6 Hz, 1H), 0.86 (d,J=6.6 Hz, 3H), 0.83 (d,J=6.5 Hz, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO)δ169.14, 167.24, 67.13, 60.97, 53.20, 45.47, 23.78, 23.63, 21.97, 20.60。從核磁共振碳譜低場(chǎng)δ169.14，167.24說(shuō)明是2個(gè)酰胺上的碳，結(jié)合核磁共振氫譜δ8.18, 7.99這2個(gè)氮上的活潑氫，說(shuō)明是一個(gè)典型環(huán)二肽結(jié)構(gòu)。有2個(gè)二重峰的甲基，有1個(gè)低場(chǎng)的二重峰的甲基，同時(shí)δ5.00是一個(gè)二重峰，說(shuō)明含有1個(gè)羥基。同時(shí)質(zhì)譜結(jié)果顯示，相對(duì)分子質(zhì)量為214.04，結(jié)合文獻(xiàn)[7]，推導(dǎo)E7-4結(jié)構(gòu)為Cyclic(Thr-Leu)。

化合物E7-7：白色粉末(甲醇)，1H NMR (600 MHz, DMSO)δ9.19 (s, 1H), 7.82 (d,J=2.5 Hz, 1H), 7.63 (d,J=2.5 Hz, 1H), 7.48 (d,J=8.0 Hz, 1H), 7.32 (d,J=8.1 Hz, 1H), 7.10～7.02 (m, 1H), 7.02～6.94 (m, 2H), 6.58 (d,J=8.5Hz, 2H), 6.51 (d,J=8.5 Hz, 2H), 3.94 (t,J=6.3 Hz, 1H), 3.77 (d,J=6.9 Hz, 1H), 2.79 (dd,J=14.5, 4.3 Hz, 1H), 2.43 (ddd,J=18.1, 14.0, 5.5 Hz, 2H), 1.78 (dd,J=13.6, 7.0 Hz, 1H)；13C NMR (150 MHz, DMSO)δ167.25, 166.76, 156.43, 136.53, 131.15, 127.93, 126.86, 124.84, 121.35, 119.19, 118.89, 115.36, 111.78, 109.34, 56.33, 55.70, 31.14, 30.39。如圖6所示，根據(jù)核磁共振碳譜δ167.25, 166.76和核磁共振氫譜δ7.82,7.63這2個(gè)二重峰的活潑氫，表明化合物含有一個(gè)典型的環(huán)二肽骨架。從核磁共振氫譜δ6.58 (d,J=8.5 Hz, 2H), 6.51 (d,J=8.5 Hz, 2H)，結(jié)合碳譜δ156.43的碳，說(shuō)明含有1個(gè)對(duì)位羥基取代的苯環(huán)；低場(chǎng)芳香區(qū)有個(gè)鄰位取代苯環(huán)，同時(shí)質(zhì)譜結(jié)果顯示，相對(duì)分子質(zhì)量為349.14。結(jié)合文獻(xiàn)[8]，推導(dǎo)E7-7結(jié)構(gòu)為Cyclic(Tyr-Trp)。

圖6　E7-7核磁共振氫譜和碳譜圖

化合物E7-6：13C NMR(150 MHz, DMSO)δ167.94, 166.75, 156.85, 131.70, 126.33, 115.33, 56.15, 52.73, 44.18, 38.18, 23.41, 23.25, 21.81。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[9]，推導(dǎo)E7-6的結(jié)構(gòu)為Cyclic(Tyr-Val)。

化合物E7-8：13C NMR (150 MHz, DMSO)δ166.73, 166.63, 156.56, 137.12, 131.28, 130.20, 128.64, 126.90, 115.48, 56.18, 55.86, 38.99。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[10]，推導(dǎo)E7-8結(jié)構(gòu)為Cyclic(Phe-Tyr)。

化合物E6-5：13C NMR (150 MHz, DMSO)δ168.12, 166.27, 136.50, 130.82, 128.47, 127.10, 55.81, 50.17, 20.14。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[10]，推導(dǎo)化合物E6-5結(jié)構(gòu)為Cyclic(Phe-Ala)。

化合物E6-4：13C NMR (150 MHz, DMSO)δ167.59, 166.09, 136.43, 130.50, 128.57, 127.20, 55.94, 44.13。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[11]，推導(dǎo)化合物E6-4結(jié)構(gòu)為Cyclic(Phe-Gly)。

化合物E3-23：13C NMR (150 MHz, DMSO)δ170.50, 165.67, 59.64, 58.64, 45.08, 35.34, 28.37, 24.32, 22.47, 15.41, 12.71。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[10]，推導(dǎo)化合物E3-23結(jié)構(gòu)為Cyclic (Ile-Pro)。

化合物E8-6B：13C NMR (150 MHz, CD3OD)δ169.27, 167.32, 156.54, 131.33, 125.65, 114.88, 56.17, 50.32, 38.12, 19.01。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[12]，推導(dǎo)化合物E8-6B結(jié)構(gòu)為Cyclic(Tyr-Leu)。

化合物E4-2A:13C NMR (150 MHz, DMSO)δ170.70, 165.67, 59.93, 58.69, 45.08, 28.30, 28.15, 22.53, 18.78, 16.84。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[13]，推導(dǎo)化合物E4-2A結(jié)構(gòu)為Cyclic(Pro-Val)。

化合物E4-3A:13C NMR (150 MHz, DMSO)δ169.35, 169.31, 53.89, 49.42, 42.58, 24.08, 23.34, 22.24, 18.29。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[12]，推導(dǎo)化合物E4-3A結(jié)構(gòu)為Cyclic(Ala-Leu)。

化合物E4-10B：13C NMR (150 MHz, DMSO)δ168.89, 167.29, 59.98, 52.85, 44.39, 40.53, 40.41, 40.27, 40.13, 40.00, 39.86, 39.72, 39.58, 31.91, 24.01, 23.54, 22.22, 19.21, 17.80。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[14]，推導(dǎo)化合物E4-10B結(jié)構(gòu)為Cyclic(Leu-Val)。

化合物E5-4A:1H NMR (600 MHz, CD3OD)δ7.05 (d,J=8.5 Hz, 2H), 6.72 (d,J=8.6 Hz, 2H), 4.37 (td,J=5.1, 1.9 Hz, 1H), 4.05 (ddd,J=10.9, 6.3, 1.9 Hz, 1H), 3.56 (dt,J=11.9, 8.4 Hz, 1H), 3.40 ～ 3.33 (m, 1H), 3.07 (ddd,J=31.4, 14.2, 4.9 Hz, 1H), 2.11 (dtd,J=10.7, 6.0, 4.4 Hz, 1H), 1.87 ～ 1.76 (m, 1H), 1.30 ～1.19 (m, 1H)。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[14]，化合物E5-4A為 Cyclic(Tyr-Pro)。

化合物E5-4B:13C NMR (150 MHz, CD3OD)δ169.84, 167.80,59.50, 50.24, 38.86, 24.23, 19.50, 14.13, 10.77。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[11]，化合物E5-4B為Cyclic(Ala-Ile)。

化合物E5-4C:13C NMR (150 MHz, CD3OD)δ170.05, 169.54, 53.22, 50.52, 43.64, 23.89, 22.11, 20.69, 19.45。其中E5-4C的核磁共振氫譜δ0.99 (d,J=6.6 Hz, 3H), 0.97 (d,J=6.6 Hz, 3H)，而E5-4B的核磁共振氫譜δ1.04 (d,J=7.1 Hz, 3H), 0.97 (t,J=7.4 Hz, 3H),說(shuō)明E5-4B含有異亮氨酸而E5-4C含有亮氨酸。結(jié)合質(zhì)譜和文獻(xiàn)[14]，化合物E5-4C為Cyclic(Ala-Leu)。

3結(jié)論

生防菌HN011對(duì)多種病原菌均有明顯的拮抗作用，通過(guò)濾紙片試驗(yàn)表明HN011發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、水稻白葉枯病菌有明顯的抑菌現(xiàn)象。但目前鮮見(jiàn)對(duì)其有效成分進(jìn)行報(bào)道。因此，有必要對(duì)生防菌HN011的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。本研究通過(guò)少量發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵液不同的極性段進(jìn)行分部，通過(guò)活性跟蹤，確定了活性部位主要集中在乙酸乙酯部位和氯仿部位，由于氯仿部位的活性和極性與乙酸乙酯部位差別不明顯，因此放大發(fā)酵后，為了節(jié)省時(shí)間和成本，在使用石油醚進(jìn)行萃取后，直接使用乙酸乙酯對(duì)水相進(jìn)行萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得浸膏。對(duì)乙酸乙酯部位的浸膏30.6 g進(jìn)行劃段和活性試驗(yàn)，結(jié)果表明活性物質(zhì)主要集中在餾分6和餾分7中，對(duì)這2個(gè)活性段進(jìn)行分離，得到6個(gè)單體化合物。其中化合物E7-7[Cyclic(Tyr-Trp)]首次在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)。為了系統(tǒng)了解生防菌代謝產(chǎn)物的類(lèi)型，對(duì)其他的活性不明顯的餾分段進(jìn)行分離,得到9個(gè)單體化合物。單體化合物通過(guò)核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明通過(guò)活性追蹤等方法，生防菌HN011發(fā)酵液活性段的次級(jí)代謝產(chǎn)物主要是一些環(huán)二肽。

環(huán)二肽是由2個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵環(huán)合形成的二酮哌嗪類(lèi)化合物，也是自然界中最小的環(huán)肽化合物, 具有多種生物活性[15]。近年來(lái)，環(huán)二肽在生物防治的運(yùn)用上也屢有發(fā)現(xiàn)。在試驗(yàn)分離中，次級(jí)產(chǎn)物全部是環(huán)二肽，說(shuō)明環(huán)二肽在防治上有重大的意義。環(huán)二肽及其衍生物具有多種生物活性，尤其是在抑菌方面具有顯著的效果。艾峰等[16]從東海微生物中分離出6種對(duì)鰻弧菌具有顯著抑制活性的環(huán)二肽；諾爾斯鏈霉菌StreptomycesnourseiHazen的次生代謝產(chǎn)物白諾氏菌素(Albonoursin)為Cyclo(Phe-Leu)的四脫氫衍生物,具有顯著抗菌作用[17]。生防菌活性代謝產(chǎn)物的分離是在抑制金黃色葡萄球菌的指示下進(jìn)行的，試驗(yàn)結(jié)果表明各組分的抑菌活性不一致，分離的結(jié)果顯示各組分的成分也不同，說(shuō)明生防菌HN011不同的代謝產(chǎn)物具有不同的生物活性；生防菌具有顯著的抑制各種病原菌的作用很大程度是因?yàn)槠浯x產(chǎn)物具有多樣性。

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【責(zé)任編輯周志紅】

Research on secondary metabolites fromBacillus

amyloliquefaciensstrain HN011

ZHANG Longlai1, KANG Xianghui1, WEI Xiaoyi2, XU Hanhong1

(1 College of Agricultrue, South China Agricultural University/Key Laboratory of Natural Pesticide & Chemical Biology,

Ministry of Education, Guangzhou 510642, China; 2 South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences/Key

Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, Guangzhou 510650, China)

Abstract：【Objective】 To separate and identify secondary metabolites of bio-control bacterium strain HN011 in YPD zymotic fluid. 【Method】By a small amount of fermentation (1 L), the zymotic fluid was extracted by using liquid-liquid extraction of petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol. The active portions were determined byStaphylococcusaureusbioassay. The pure compounds were isolated from the active portions by amplifying fermentation. The pure compounds were identified by NMR and mass spectrometry. 【Result】 The bioassay results showed that the activities of different solvent extracts from the zymotic fluid were different. The most obvious activity was ethyl acetate portion, followed by chloroform. The activity of n-butanol portion was weak，and petroleum ether and water portions were not obvious. By amplifying fermentation, fifteen pure compounds were isolated from the bioassay portions, and identified as mainly small molecule cyclic dipeptides based on their structures.【Conclusion】 The secondary metabolites，which are produced by bio-control bacterium strain HN011 in YPD zymotic fluid，are mainly small molecule cyclic dipeptides.

Key words：bio-pesticide； bio-control bacterium；Bacillusamyloliquefaciens； secondary metabolite； cyclic dipeptide

中圖分類(lèi)號(hào)：S476

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-411X(2016)01-0063-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31171886)

作者簡(jiǎn)介：張龍來(lái)(1988—)，男，碩士，E-mail：zchangll@qq.com; 通信作者：徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail：hhxu@scau.edu.cn

收稿日期：2015-02-11優(yōu)先出版時(shí)間：2015-12-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1132.024.html

張龍來(lái)， 康向輝， 魏孝義，等.1株解淀粉芽孢桿菌HN011抑菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(1):63-69.