新疆首次臨床分離新生隱球菌菌株分子鑒定、基因分型及體外藥物敏感性研究

尤麗吐孜·許合熱提 哈地麗亞·哈斯木 王曉東 鄧淑文 帕麗達(dá)·阿布利孜

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊 830053；2.第二軍醫(yī)大學(xué)上海長征醫(yī)院真菌研究所，上海 200003)

·論著·

新疆首次臨床分離新生隱球菌菌株分子鑒定、基因分型及體外藥物敏感性研究

尤麗吐孜·許合熱提1哈地麗亞·哈斯木1王曉東1鄧淑文2帕麗達(dá)·阿布利孜1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊 830053；2.第二軍醫(yī)大學(xué)上海長征醫(yī)院真菌研究所，上海 200003)

目的 對新疆首次臨床分離的5株新生隱球菌進(jìn)行分子鑒定、RAPD-PCR基因分型及體外藥物敏感性研究。方法 5株新生隱球菌分子鑒定采用核糖體DNA大亞基 (LSU rDNA)D1/D2基因區(qū)域分子鑒定。分子分型采用引物SEQ-6結(jié)合RAPD-PCR法擴(kuò)增5株新疆臨床分離新生隱球菌菌株及5株由上海長征醫(yī)院提供分離自上海新生隱球菌菌株，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型進(jìn)行基因型判定。采用臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會 (CLSI)的酵母微量液基稀釋法 (M27-A3)測定5株新疆臨床分離新生隱球菌菌株對6種抗真菌藥 (伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、特比萘芬、氟康唑、5-氟胞嘧啶)的體外敏感性。結(jié)果 5株新疆臨床分離隱球菌菌株經(jīng)過D1/D2區(qū)域序列分析在基因Bank中比對后鑒定為新生隱球菌。5株新疆臨床分離新生隱球菌和5株上海新生隱球菌菌株經(jīng)RAPD-PCR法擴(kuò)增，帶型顯示分為A、B、C、D 4個基因型,其中新疆5株菌株A型1株、其余4株均為B型,上海菌株B型為1株，C型3株、D型1株，5株新疆臨床分離新生隱球菌株對伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、特比萘芬的MIC值 (μg/mL)范圍依次為：0.062 5～0.25、0.25～1、0.125～0.5、1～2，對氟康唑、5-氟胞嘧啶MIC值較高，MIC值范圍依次為：4～16、8～32。結(jié)論 新疆臨床分離5株隱球菌株采用D1/D2基因序列鑒定為新生隱球菌。RAPD-PCR分型顯示新疆臨床分離5株新生隱球菌株以B型基因型為主。A型和B型對伏立康唑、兩性霉素B敏感,對伊曲康唑、特比萘芬劑量依賴型敏感，對氟康唑、5-氟胞嘧啶耐藥。

新生隱球菌；新疆；RAPD-PCR基因分型；體外藥物敏感性

[Chin J Mycol，2016，11(6):327-331]

新生隱球菌作為侵襲性真菌感染的重要病原真菌，嚴(yán)重危害人類健康。尤其是在合并HIV感染、造血干細(xì)胞移植、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、長期用糖皮質(zhì)激素或腫瘤化療的患者，其患病率和死亡率更高[1]。國內(nèi)外對隱球菌病基因分型及藥物敏感性等方面均有相關(guān)報道[2-6]，在國外主要見于AIDS人群，如在非洲的AIDS人群中，隱球菌病的發(fā)病率高達(dá)30%[7]，且有隱球菌病暴發(fā)流行的報道。在我國，隱球菌病呈散發(fā)性，多數(shù)為免疫受損的人群[8]，主要分布于廣西省、河南省、云南省以及上海市、廣西省、云南省、廣東省、北京市[9-12]等發(fā)達(dá)城市，至今新疆未見報道。本研究首次報道了5株新疆首次臨床分離新生隱球菌的分子鑒定，描述新疆新生隱球菌基因型特點(diǎn)及5株新疆臨床分離菌株對兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、特比萘芬的抗真菌藥的體外敏感性，為臨床正確診斷，治療隱球菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 5株臨床分離新生隱球菌，分離自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，其中XYZ6008a、XYZ6008b均分離自同一患者治療前后兩次發(fā)病時的皮膚組織。5株臨床分離新生隱球菌，分離自上海長征醫(yī)院，作為參考菌株 (見表1)。

抗真菌藥物 6種抗真菌藥物分別是購自Sigma公司的兩性霉素B、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、特比萘芬和購自輝瑞制藥公司的氟康唑。

1.2 方法

分子鑒定 形態(tài)學(xué)初步鑒定：包括腦脊液墨汁染色直接顯微鏡下觀察，和接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h觀察菌落形態(tài)。

將形態(tài)鑒定為隱球菌的菌落接種到200 μL InstaGene提取液中震蕩混勻，56℃加熱10 min后100℃孵育8 min，3 500 r/min離心5 min，上清液為DNA，置-20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)生理學(xué)特征鑒定為新生隱球菌的10株菌進(jìn)行LSU rDNA 25S D1/D2區(qū)域的序列分析確切鑒定 (見表2)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件略。擴(kuò)增產(chǎn)物用SUPRECTM-02 (TaKaRa)純化，BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA，USA)標(biāo)記后ABIPRISM3100儀序列測定[13]。

表1 本研究所有新生隱球菌菌株信息

Tab.1 Information of theCryptococcusneoformansstrains in this study

序號菌株地區(qū)標(biāo)本診斷基因型1XYZ6007新疆腦脊液隱球菌性腦膜炎A2XYZ6008a新疆皮膚組織白血病伴皮膚隱球菌病B3XYZ6008b新疆皮膚組織白血病伴皮膚隱球菌病B4XYZ6004新疆腦脊液隱球菌性腦膜炎B5XYZ6005新疆腦脊液隱球菌性腦膜炎B680379上海腦脊液隱球菌性腦膜炎B7ZP910上海腦脊液隱球菌性腦膜炎C8827016上海腦脊液隱球菌性腦膜炎C9HX17上海腦脊液隱球菌性腦膜炎C10HX19上海腦脊液隱球菌性腦膜炎D

注：XYZ.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院真菌保藏中心,余由第二軍醫(yī)大學(xué)上海長征醫(yī)院真菌研究所提供

表2 D1/D2區(qū)域的PCR引物序列及RAPD-PCR隨機(jī)引物序列

Tab.2 D1/D2 area of PCR amplification primers and RAPD-PCR random primer sequence

引物名稱序列NL-15'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'NL-4m5'-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3'SEQ-65'-CCCGTCAGCA-3'

RAPD-PCR反應(yīng)體系及條件 采用隨機(jī)引物SEQ-6擴(kuò)增新生隱球菌的DNA產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系20 μL，包括：DNA模板3 μL，2×Taq PCR Master Mix (dNTP、HCl、KCl、MgCl2)10 μL，引物 (見表2)0.4 μL、雙蒸水6.6 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物在含EB的1.5%瓊脂糖凝膠上100 V電泳25 min，紫外燈下觀察結(jié)果。

5株臨床分離菌株的體外藥物敏感試驗 試驗前5株受試菌均接種PDA培養(yǎng)72 h使其活化，用無菌棉簽頭部輕輕滾動拭取已活化菌株放入2 mL的含0.05%Tween40的0.85%無菌生理鹽水中混勻，靜置3～5 min，根據(jù)M27-A3標(biāo)準(zhǔn)，用分光光度計測530 nm的OD值，再將菌懸液用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋50倍，最終得到所需2倍的接種菌懸液濃度 (0.5×104～5×104CFU/mL)。選用ATCC22019 (近平滑念珠菌)作為藥敏質(zhì)控菌株。采用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會 (CLSI)方案[14]對兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、特比萘芬 (購自Sigma公司的兩性霉素B、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、特比萘芬和購自輝瑞制藥公司的氟康唑)體外藥物敏感性微量液基稀釋法 (M27-A3)。結(jié)果判定在顯微鏡下進(jìn)行。所有菌株均進(jìn)行2次重復(fù)試驗。

最低抑菌濃度 (MIC)的判定標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡下觀察,與陽性對照孔對比，完全抑制,無生長的最低濃度。將5株新疆臨床分離菌在35℃培養(yǎng)72 h判定最低抑菌濃度：在顯微鏡下觀察,與陽性對照孔對比，完全抑制,無生長的最低濃度。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分子鑒定

墨汁染色鏡檢，可見到透明莢膜包裹著菌細(xì)胞，菌細(xì)胞常有出芽，但不生成假菌絲，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)，37℃培養(yǎng)72 h生成酵母型菌落，初呈白色，1周后轉(zhuǎn)淡黃或棕黃、濕潤黏稠，狀似膠汁。每一株臨床分離菌株擴(kuò)增D1/D2區(qū)域序列在基因BANK核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性序列搜索比對，進(jìn)一步通過分子序列證實所有菌株為新生隱球菌。

2.2 RAPD-PCR擴(kuò)增

本研究中的10株新生隱球菌顯示了4個基因型 (見圖1)。A型有1株為新疆臨床分離株；B型有5株：分別是4株新疆臨床分離株和1株上海株；C型有3株：3株上海株；D型為1株上海株。

圖1 新生隱球菌經(jīng)PCR-RAPD基因分型瓊脂糖凝膠電泳圖 (M.標(biāo)準(zhǔn)DNAMaker；1.XYZ6007,即A型；2-6.XYZ6008a、XYZ6008b、XYZ6004、XZY6005、80379，即B型；7-9.ZP910、827016、HX17，即C型；10.HX19,即D型

Fig.1 Electrophoresis of PCR products:M.maker；lanel 1.XYZ6007 (typeA)；lanel 2-6.XYZ6008a,XYZ6008b,XYZ6004,XZY6005,80379 (typeB)；lanel 7-9.ZP910,827016,HX17 (typeC)；lanel 10.HX19 (typeD)

5株新疆臨床分離新生隱球菌對6種抗真菌藥物體外藥敏MIC值見表3，MIC值由低到高依次為：伏立康唑0.062 5～0.25 μg/mL、伊曲康唑0.25～1 μg/mL、兩性霉素B 0.125～0.5 μg/mL、特比萘芬1～2 μg/mL，對氟康唑、5-氟胞嘧啶MIC值較高，MIC值范圍依次為：4～16 μg/mL、8～32 μg/mL。

3 討 論

隱球菌病是由隱球菌引起的一種嚴(yán)重深部真菌病，新生隱球菌為隱球菌屬重要致病菌種。新生隱球菌包括格魯比、新生和格特變種，2002年，Kwon-Chung[15]等將格特變種上升至種的水平，并命名為格特隱球菌，現(xiàn)已被國際上接受。隱球菌主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺臟，亦可侵犯皮膚、骨骼等器官，世界各地均有流行，每年約造成62萬人死亡[16]。在國外隱球菌病主要見于AIDS人群，比如在美國隱球菌病發(fā)病人群中有7%～8%是艾滋病患者[7]，在非洲的AIDS人群中，隱球菌病的發(fā)病率高達(dá)30%，且有隱球菌病暴發(fā)流行的報道[17]，在我國，主要好發(fā)于免疫功能低下的人群，如大劑量使用糖皮質(zhì)激素及抗腫瘤化療藥物的患者、ADIS患者等。該病起病隱匿，病死率極高，預(yù)后差，因此快速準(zhǔn)確的檢測新生隱球菌感染對于疾病治療有重要價值，分子流行病學(xué)研究也顯得日益重要。

表3 新疆臨床分離新生隱球菌對抗真菌藥物的MIC值

注：ICZ.伊曲康唑,VCZ.伏立康唑,AmB.兩性霉素B,TBF.特比萘芬,FCZ.氟康唑,5-FC.5-氟胞嘧啶

早在1993年Meyer等就應(yīng)用PCR指紋技術(shù)對酵母菌進(jìn)行種和株的鑒定[18]，1999年Meyer等對世界多國的共356株隱球菌進(jìn)行分型[19]。2008年，陳江漢等[20]檢測中國16個省，1980～2006年收集的120株標(biāo)本，應(yīng)用PCR指紋技術(shù)將129株隱球菌分為相應(yīng)的8個基因型，與文獻(xiàn)報道[21]的全球新生隱球菌的基因型一致。在國內(nèi)的隱球菌病感染大部分來自腦脊液，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染合并肺隱球菌病,其病死率高達(dá)55%[22]。因此早期開展有效的抗真菌治療對于患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸十分重要。在新疆至今未見新生隱球菌基因分型、體外藥敏試驗方面的報道。

本文分析了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院首次臨床分離5株新生隱球菌，通過分子分型，進(jìn)一步分析基因型，將上海5株臨床分離新生隱球菌作為參考菌株，以期了解新疆新生隱球菌的分子流行病學(xué)特征及體外抗真菌藥物敏感性。本文參考Reginaldo等[23]用隨機(jī)引物SEQ-6結(jié)合RAPD-PCR法具體分析了新生隱球菌的基因多態(tài)性，選用引物SEQ-6結(jié)合RAPD-PCR方法對10株新生隱球菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示4種基因型，即A、B、C、D。本研究中的5株新疆臨床分離菌株與上海5株菌有完全相同的基因型，也有交叉重疊的型，新疆菌株以B型為主，作為參考的上海菌株以C型為主，兩個地區(qū)基因型明顯不同，新疆有自己獨(dú)立的基因型。

本研究參照CLSIM27-A3方案，評價了5株分離自新疆的新生隱球菌對兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、特比萘芬的最低抑菌濃度MIC值。結(jié)果顯示受試菌株對伏立康唑 (0.062 5～0.25 μg/mL)、兩性霉素B (0.125～0.5 μg/mL)敏感，對伊曲康唑 (0.25～1 μg/mL)、特比萘芬 (1～2 μg/mL)劑量依賴，對氟康唑 (4～16 μg/mL)、5-氟胞嘧啶 (8～32 μg/mL)耐藥，與文獻(xiàn)報道一致[12]。本研究中伏立康唑?qū)?株新疆菌株的MIC值均低，符合美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)上市的新型三唑類藥物伏立康唑?qū)π律[球菌具有較好的體外敏感性[24]?；蛐虯和B對上述藥物的敏感性無明顯差異，因此基因型與藥物敏感性無明顯相關(guān)性。

本研究中新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離5株菌中2株菌 (XYZ6008a、XYZ6008b)均分離于同一慢性白血病患者的前后兩次的皮膚潰瘍處,用引物SEQ-6擴(kuò)增的條帶完全一致于對抗真菌藥的體外敏感性也基本一致，提示治療前的菌株和治療后復(fù)發(fā)的皮損分離株為同一個菌株，考慮為前次治療不徹底復(fù)發(fā)。

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[本文編輯] 王 飛

·消息·

Molecular identification and genotyping andinvitrodrug sensitivity study of the first five clinical isolates ofCryptococcusneoformansin Xinjiang

Yultuz·Xohrat1,Kadirye·Kasim1,WANG Xiao-dong1,DENG Shu-wen2,Prida·Abliz1

(1.DermatologyoftheFirstAffiliatedhospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830053;2.TheFungusInstituteofShanghaiChangzhenghospital,Shanghai200003)

Objective For the first time to perform the molecular identification,RAPD-PCR genotyping andinvitrodrug sensitivity study of 5 clinical strains ofCryptococcusneoformansin Xinjiang.Methods Molecular classification using primer SEQ-6 from big subunit ribosomal DNA (LSU rDNA) D1/D2 gene region and RAPD-PCR method were applied in 5 strains of clinical isolated XinjiangCryptococcusneoformansstrains and 5Cryptococcusstrains provided by Shanghai Changzheng hospital.Sensitivityinvitroof 5 clinical isolated XinjiangCryptococcusneoformansstrains of the above 6 kinds of antifungal drugs (Voriconazole,itraconazole,amphotericin B,terbinafine,fluconazole,5-fluorine cytosine )were judged according to clinical laboratory standards institute (CLSI) trace liquid dilution method of yeast (M27-A3).Result The 5 strains of Xinjiang were identified asCryptococcusneoformansthrough D1/D2 region sequence analysis.All 10 strains are divided into A,B,C,D 4 genotype by RAPD-PCR.One Xinjiang strain was type A,the rest 4 strains were type B;Among 5 Shanghai strains,1 strain was type B,3 strainswere type C,1 strain was typeD.For the 5 Xinjiang clinicalCryptococcusneoformansstrains,to the MIC value ranges of voriconazole,itraconazole,amphotericin B and terbinafine were as following:0.062 5-0.25 μg/mL,0.25-1 μg/mL,0.125-0.5 μg/mL,1-2 μg/mL,respectively;MIC value ranges of fluconazole,5-fluorine cytosine MIC value were much higher as:4-16 μg/mL,8-32 μg/mL,respectively.MIC values of genotype A and B to voriconazole were 0.062 5-0.125 μg/mL.Conclusion The 5 Xinjiang clinical isolates ofCryptococcuswere identified asCryptococcusneoformansusing D1/D2 genes analysis.RAPD-PCR revealed these clinicalCryptococcusneoformansstrain in Xinjiang with priority given to type B genotypes.Type A and type B isolates weremore sensitive to voriconazole,amphotericin B,itraconazole and terbinafine.

Cryptococcusneoformans;Xinjiang;RAPD-PCR genotyping;antifungal sensitivity

國家自然科學(xué)基金 (81360237)

尤麗吐孜·許合熱提，女 (維吾爾族)，碩士，住院醫(yī)師.E-mail:m13899841261@163.com

帕麗達(dá)·阿布利孜,E-mail:palidae@aliyun.com

R 379.5

A

1673-3827(2016)11-0327-05

2016-09-01