上海某綜合性醫(yī)院秋季室內外環(huán)境空氣中真菌種群分布的研究

洪南 方文捷 劉加 陳敏 潘煒華 廖萬清

(第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所，上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室，全軍真菌病重點實驗室，上海 200003)

·論著·

上海某綜合性醫(yī)院秋季室內外環(huán)境空氣中真菌種群分布的研究

洪南 方文捷 劉加 陳敏 潘煒華 廖萬清

(第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所，上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室，全軍真菌病重點實驗室，上海 200003)

目的 監(jiān)測目前上海地區(qū)某綜合性醫(yī)院室內外環(huán)境空氣中真菌種群分布特征，為臨床侵襲性真菌感染的防治提供科學依據(jù)。方法 于2015年秋季以基于微生物氣溶膠采集的空氣采樣器采樣法與曝皿法隨機對上海地區(qū)某綜合性三甲醫(yī)院的26處室內及7處室外環(huán)境進行同步空氣采樣，相關樣本在含有氯霉素的沙氏培養(yǎng)基上經培養(yǎng)、分離、純化及分子鑒定后，對不同采樣地點真菌種群結構予以統(tǒng)計學分析。結果 上海地區(qū)綜合性三甲醫(yī)院室內空氣中青霉屬 (約24.14%)在真菌種群結構中占有明顯優(yōu)勢，室外空氣中則以分枝孢子菌屬占有優(yōu)勢 (約34.09%)，青霉屬在室內空氣中所占比重 (約24.14%)明顯高于室外 (11.09%)。結論 雖然上海地區(qū)的醫(yī)療水平國內領先，且被調查醫(yī)院已按相關規(guī)定進行了日常環(huán)境消毒工作，但被調查醫(yī)院室內外空氣中仍被發(fā)現(xiàn)存在高度多樣性的真菌種群結構，且包含了常見的機會致病真菌如煙曲霉等，繼續(xù)加強綜合性醫(yī)院室內外環(huán)境中真菌等病原微生物的監(jiān)測和加強院內感染的控制是非常必要的。

醫(yī)院污染；室內真菌；空氣采樣；真菌感染

[Chin J Mycol，2016，11(6):361-365]

近30 a來，隨著免疫抑制劑、化療藥物、糖皮質激素、廣譜抗生素在臨床的廣泛應用及HIV在全球的蔓延，免疫抑制患者的數(shù)量持續(xù)增多，侵襲性真菌病的發(fā)病率、病死率逐年增加。Martinez-Marcos等[1]于1994年始進行的一項前瞻性隊列研究顯示：腎移植術后患者中，11%的感染為真菌源性感染。醫(yī)院周圍環(huán)境空氣中真菌的含量、種群結構與院內真菌感染的發(fā)生有一定關聯(lián)[2-3]。1994～2002年，F(xiàn)aure等[4]對醫(yī)院部分工作環(huán)境中的真菌含量及種類進行了長達8年的監(jiān)測，結果顯示以念珠菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬為主要病原體的院內真菌感染逐年增加?？諝馐钦婢廴緜鞑サ闹匾d體[5]，醫(yī)院內各區(qū)域空氣真菌數(shù)量的監(jiān)測對控制院內感染意義重大，醫(yī)院室內外環(huán)境空氣中真菌的種群分布正日漸引起醫(yī)學真菌學、流行病學及感染控制等領域專家的高度關注。室內空氣真菌受多種因素影響，包括濕度、通氣、溫度、室內有機材料以及室外空氣真菌負荷程度等[6-7]。多項研究結果共同提示：醫(yī)院室內空氣真菌負荷在不同的季節(jié)差異明顯，而秋季是醫(yī)院室內空氣真菌負荷最高的季節(jié)[8-10]。因此，本研究在2015年秋季選取上海地區(qū)某綜合性三甲醫(yī)院，以目前醫(yī)院周圍環(huán)境微生物監(jiān)測主流的曝皿法和空氣采樣器采樣法[11]隨機對該院室內外不同地點環(huán)境中的空氣樣本進行同步采樣，相關樣品經培養(yǎng)及分離、純化后做分子生物學鑒定及統(tǒng)計學分析，旨在監(jiān)測目前上海地區(qū)綜合性醫(yī)院室內外環(huán)境空氣中的真菌種群分布特征，為臨床侵襲性真菌感染的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

空氣采樣器采樣法采用基于微生物氣溶膠采集的Coriolis μ型濕壁氣旋式采樣機 (法國Bertin公司)，直徑90 mm的含氯霉素的沙氏培養(yǎng)基平皿 (美國Becton Dickinson公司)，15 mL離心管，10 mL雙蒸水；曝皿法采用直徑90 mm的含氯霉素的沙氏瓊脂培養(yǎng)基平皿 (美國Becton Dickinson公司)。

1.2 采樣地點

在所選醫(yī)院的住院部大樓中從每個科室的病房中各隨機選取出一個病房作為醫(yī)院室內環(huán)境的采樣地點，共26處；從門診大樓各層及樓頂隨機選取一處工作環(huán)境作為醫(yī)院室外環(huán)境的采樣地點，共7處 (見表1～2)。

表1 醫(yī)院室外環(huán)境空氣真菌采樣結果

Tab.1 Airborne fungi sampling results of outdoor hospital environments

地點曝皿法空氣采樣器采樣法每皿菌落數(shù)換算值(CFU/m3)每皿菌落數(shù)換算值(CFU/m3)門診1樓151182.69211211門診2樓2157.6977門診3樓5394.236161門診4樓178.844848門診5樓2157.695757門診6樓178.848888門診樓頂9709.618383

1.3 采樣方法

采樣在2015年9～11月間進行。參照ISO 14698-1生物污染控制總則推薦的采樣原則，空氣采樣器采樣法：將Coriolis μ型濕壁氣旋式采樣器置于病房中央離地1.5 m處，向采樣杯中加入10 mL雙蒸水，設定空氣流速為200 L/min，在采樣現(xiàn)場采樣5 min后將液體樣品均勻涂布于培養(yǎng)基平皿表面；曝皿法:將直徑90 mm的培養(yǎng)基平皿置于采樣現(xiàn)場，在空氣中暴露15 min；兩種方法采樣后所得的培養(yǎng)基平皿均放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d且每日觀察真菌生長情況。

1.4 空氣菌落數(shù)換算方法

曝皿法的換算公式[12]:空氣菌落數(shù) (CFU/m3)=N×50 000/(A×t),其中N為每皿菌落數(shù)，A為平皿面積 (cm2),t為平皿暴露于空氣中的時間 (min)；空氣采樣器采樣法的換算公式[11]：空氣菌落數(shù) (CFU/m3)=N×1 000/(Q×t),其中N為每皿菌落數(shù)，Q為空氣流量 (L/min),t為采樣時間 (min)。

1.5 真菌分離純化及鑒定方法

觀察采樣平皿上的真菌菌落生長3～7 d后，采用小培養(yǎng)的方法將單個菌落分離到新的含氯霉素的沙氏培養(yǎng)基平皿 (美國Becton Dickinson公司)上培養(yǎng)，根據(jù)不同真菌形態(tài)學特征，肉眼直接觀察菌落和顯微鏡下觀察菌絲、孢子等特征性結構初步鑒定真菌至屬水平，抽提DNA擴增ITS (internal transcribed spacer)片段、測序并作序列比對進行分子生物學鑒定至屬或種水平[13]。

表2 醫(yī)院室內環(huán)境空氣真菌采樣結果

1.6 統(tǒng)計方法

采用SAS 8.0統(tǒng)計分析軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計描述采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距，樣本比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 曝皿法和氣旋法采樣結果比較

本研究平行采用兩種方法對被研究醫(yī)院26處室內環(huán)境和7處室外環(huán)境進行了空氣真菌檢測，發(fā)現(xiàn)曝皿法采樣所得每皿菌落數(shù)顯著低于空氣采樣器采樣法，兩者差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；曝皿法采樣所得空氣菌落數(shù)換算值卻普遍高于空氣采樣器采樣法所得換算值,兩者差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，詳見表3。

2.2 醫(yī)院室內外環(huán)境空氣真菌菌種分布情況

在2015年9～11月間，空氣采樣器采樣法采集醫(yī)院室內空氣真菌得到的26個平皿上分離得到菌落1 692個，經ITS測序及序列比對后鑒定為11個屬真菌，居前4位的分別是：青霉屬The genusPenicillium(24.14%)、分枝孢子菌屬The genusCladosporium(21.27%)、曲霉屬The genusAspergillus(20.19%)及鏈格孢屬The genusAlternaria(12.70%)；空氣采樣器采樣法采集醫(yī)院室外空氣真菌得到的7個平皿上分離得到菌落555個，經ITS測序及序列比對后鑒定為12個菌屬，居前4位的是：分枝孢子菌屬The genusCladosporium(34.09%)、鏈格孢屬The genusAlternaria(13.81%)、曲霉屬The genusAspergillus(13.06%)、青霉屬The genusPenicillium(11.09%)，詳見表4。

表3 兩種方法檢測醫(yī)院空氣真菌結果比較表

3 討 論

及時了解醫(yī)院室內外環(huán)境空氣中真菌孢子的分布密度及其種群結構對侵襲性真菌感染的防控意義重大[14]。本次實驗平行采用空氣采樣器采樣法和曝皿法兩種方法對上海某綜合性三甲醫(yī)院室內外空氣中真菌孢子的分布密度及其種群結構進行監(jiān)測，室內環(huán)境共采集鑒定到11個菌屬，室外環(huán)境共采集鑒定到12個菌屬。我們的研究發(fā)現(xiàn)曝皿法采樣后平均每皿實際生長出的真菌菌落數(shù)遠遠小于空氣采樣器采樣法所得，可能與曝皿法采樣時易受環(huán)境氣流狀態(tài)的影響，無法穩(wěn)定準確的反映空氣微生物的數(shù)量有關[12]?；谖⑸餁馊苣z采集的空氣采樣器由于受氣流狀態(tài)、顆粒大小等因素的影響相對較小，更適合于高潔凈度工作環(huán)境下的長時間采樣[15]。

表4 醫(yī)院空氣真菌種群分布

值得關注的是，本研究發(fā)現(xiàn)曲霉屬和青霉屬真菌在所調查醫(yī)院室內外環(huán)境空氣中占較大比重，且室內空氣中青霉屬所占比重明顯高于室外 (見圖1)。Nielsen等[16]的研究指出青霉在環(huán)境真菌種群結構中處于優(yōu)勢意味著此環(huán)境空氣質量的惡化和室內源性的真菌污染。諸多文獻指出曲霉產生的孢子是許多院內曲霉感染爆發(fā)的感染根源[16-18]。雖然現(xiàn)在還沒有研究明確地揭示觸發(fā)真菌感染所需的空氣中真菌孢子的最低濃度[19]，但是Alberti等[2]的研究表明環(huán)境中超過2 CFU/m3的曲霉孢子濃度是侵襲性曲霉感染發(fā)病的高危因素之一。Kontoyiannis等[20]的研究亦提示侵襲性曲霉菌感染對免疫缺陷的患者具有致死性，且其發(fā)病率在過去的20 a中一直處于穩(wěn)步上升的狀態(tài)。另外，免疫功能正常的人群也會受到真菌過敏癥的威脅，Kanny等[21]的研究指出曲霉屬和青霉屬在真菌過敏引起哮喘和變應性肺泡炎的發(fā)生發(fā)展中是重要致病因素。

圖1 醫(yī)院室內外空氣真菌種群分布比較

當前我國醫(yī)院院內環(huán)境真菌種群結構的調查研究還很不充份，但院內真菌機會性感染的發(fā)病率卻不斷上升。本研究初步反映了上海地區(qū)某綜合性三甲醫(yī)院室內外空氣真菌孢子的分布密度及其種群結構，發(fā)現(xiàn)曲霉屬和青霉屬真菌在所調查醫(yī)院室內外環(huán)境空氣中占較大比重，且室內空氣中青霉屬所占比重明顯大于室外，為防治上海地區(qū)綜合性醫(yī)院院內侵襲性真菌感染的防治提供了科學基礎。

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[本文編輯] 施 慧

A survey on indoor and outdoor airborne fungal species distribution in a general hospital located in Shanghai,China

HONG Nan,FANG Wen-jie,LIU Jia,CHEN Min,PAN Wei-hua,LIAO Wan-qing

(Instituteofdermatologyandfungaldisease,KeyLaboratoryofthearmyfungaldisease,Departmentofdermatology,ChangzhengHospital,Shanghai200003)

Objective To monitor the characteristics of airborne fungi distribution around a Chinese general hospital during Autumn in Shanghai,for scientific basis for clinical prevention and treatment of invasive fungal infections.Methods In a randomly selected general hospital in Shanghai,collecting air samples in 26 indoor and 7 outdoor environments using cyclone-based bioaerosol sampling method and precipitation method,simultaneously.The samples were cultivated,separated and purified on the Sabouraud Agar with chloramphenicol and then identified in molecular technique.All of the data obtained was analyzed statistically.Results The genusPenicillium(24.14%) was prominent in the fungal population structure in indoor environments of the enrolled hospital.In contrast,the genusCladosporium(34.09%) has the advantage in outdoor environments.The proportion of the genusPenicilliumin indoor environments (24.14%) is significantly higher than that in outdoor environments (11.09%).Conclusion Although the level of medicine in Shanghai remains leading position in China and the investigated hospital has been conducting disinfection work according to regulations,there is still a high diversity of fungal species distribution found in the surveyed hospital,which contains common opportunistic pathogenic fungi such asAspergillusfumigatus,etc.Therefore,continue to reinforce the research on environmental surveillance and infection control of general hospital is of significance.

hospital contamination;indoor fungi;air sampling;mycological infection

國家973項目 (2013CB531601，2013CB531606)；重大傳染病防治科技重大專項 (2013ZXLO004612)；國家自然科學基金 (81201269)；上海市科委專項 (14DZ2272900)

洪南，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:smallhello@126.com

廖萬清,E-mail:liaowanqing@sohu.com;潘煒華,E-mail:panweihua@medmail.com.cn

R 379

A

1673-3827(2016)11-0361-05

2016-08-30