奶牛的早期妊娠診斷研究進展

包 凱，曹 宇，劉光磊*，安朋朋，孫先枝，黃 健，李福全

（1.上海奶牛育種中心有限公司，上海 200436；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學，黑龍江 大慶 163319）

奶牛的早期妊娠診斷研究進展

包 凱1，曹 宇2，劉光磊1*，安朋朋1，孫先枝1，黃 健1，李福全1

（1.上海奶牛育種中心有限公司，上海 200436；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學，黑龍江 大慶 163319）

奶牛早期妊娠診斷一直以來是奶牛養(yǎng)殖亟待解決的問題，特別是近年來奶牛養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展，奶牛早期妊娠診斷更加影響著奶牛業(yè)的發(fā)展。簡便高效的早期妊娠診斷技術對于提高奶牛繁殖效率具有重要意義，是提高牧場管理和經(jīng)濟效益的根本要求。本文對目前奶牛的臨床早期妊娠診斷技術進行簡要概述，以期為將來的早期妊娠診斷研究提供參考。

奶牛；早期妊娠診斷；繁殖效率；經(jīng)濟效益

1 前言

經(jīng)過半個多世紀的艱辛發(fā)展，我國奶牛產(chǎn)業(yè)已經(jīng)從傳統(tǒng)、落后、粗放的養(yǎng)殖模式轉變成規(guī)?；?、標準化、精細化、產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的模式，很多先進技術也得到了大力的推廣。我國奶牛的存欄量從20世紀90年代的12萬頭，發(fā)展至今已達到1 400萬頭左右[1]。隨著奶牛存欄量的增加，畜牧業(yè)組織化水平進一步提高，奶牛的繁殖性能一直是獸醫(yī)工作人員和相關科研人員關注的熱點問題。

目前，對奶牛進行直腸檢查或利用儀器設備等進行檢測是奶牛妊娠診斷最主要的臨床方法，但直腸檢測法要在奶牛進行人工授精2個月后才能進行，如不能及時發(fā)現(xiàn)未孕的奶牛，會增加母牛的空懷時間而降低其經(jīng)濟效益。早期妊娠診斷不僅能夠改善奶牛的繁殖情況、縮短產(chǎn)犢間隔、減少空懷時間，也對提高奶牛飼養(yǎng)的經(jīng)濟效益具有極為重要意義[2]。近年來，研究人員針對奶牛的早期妊娠診斷進行了諸多研究，以期尋找到快速、簡便和經(jīng)濟的臨床方法對奶牛早期妊娠情況進行診斷。

2 奶牛的早期妊娠診斷研究進展

2.1超聲波診斷法超聲波診斷是利用物理學原理與動物組織結構聲學特質，將二者進行聯(lián)合的一種診斷方法。主要原理是：通過高頻聲波對母畜的子宮進行檢測，根據(jù)超聲的回波放大后轉化的信號不同來顯示結果。利用該方法診斷的常用儀器主要有：A超、B超以及D超（多普勒超聲），其中多普勒超聲儀應用比較廣泛。20世紀80年代末，我國應用仿制的A型測孕報警儀以及自行研發(fā)的獸用超聲多普勒檢測儀，先后開展了諸多對奶牛早期妊娠診斷的研究。鄭星道等[3]于1988年采用SCD多普勒超聲儀對483頭母牛進行了早期妊娠診斷，結果表明，針對宮血流量的聲音檢測與妊娠的符合率在奶牛配種的16～30 d和31～50 d分別為93%和98%；而針對妊娠51～79 d的奶牛受孕和未受孕的檢出率均為100%。陳兆英等[4]隨后應用該儀器從直腸檢測母畜宮血音的結果證實與直檢結果一致。鄧干臻等[5]于2004年使用B超對妊娠不同階段的137頭母畜進行檢查，結果顯示母畜配種后26～30 d妊娠確診率為89%，而配種后的31～35 d的診斷準確率為97%，超于35 d的則為100%。

2.2早孕因子診斷法1983年Koch等[6]的研究報道中指出母畜在受孕后血液、乳汁中會出現(xiàn)早孕因子。早孕因子是是一種與妊娠相關的蛋白質復合物的簡稱，屬于免疫抑制因子。研究證明，早孕因子是妊娠初期在母畜血液當中出現(xiàn)的，它在母體內(nèi)避免免疫排斥的方法是通過抑制母畜的細胞免疫完成的，從而使胎兒正常存活。早孕因子診斷法主要是對早孕因子含量進行測定，從而將其作為早期妊娠診斷的一項重要指標。目前，主要采用硫酸銅檢測法和玫瑰花環(huán)試驗法對奶牛血液或乳汁樣品進行早孕因子含量的檢測。

玫瑰花環(huán)抑制試驗一般在配種后數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)即可依據(jù)滴度進行檢測，所以該試驗不僅適用于早期妊娠診斷，也是妊娠后期判斷胎兒是否存活的指示物之一。1981年，澳大利亞科學家已經(jīng)開始用玫瑰花環(huán)抑制試驗對奶牛早期妊娠進行診斷檢測，妊娠奶牛的花環(huán)抑制滴度為2～18，而未妊娠奶牛滴度范圍為6～10。李雅茹等[7]在1988年對66頭奶牛利用該方法進行診斷，妊娠總檢出率約88%。

硫酸銅檢測法的主要檢測原理是應用硫酸根試劑可以與早孕因子發(fā)生凝集反應的特性，從而對奶牛乳汁中早孕因子的含量進行測定。王應安等[8]在1996年利用硫酸銅檢測法對人工授精40～60 d后的奶牛血液樣本進行早孕因子進行檢測，該檢測結果與直腸檢查結果相比較，其陽性準確率為88%，陰性準確率為87%。何勇軍等[9]于2001年對21頭配種后35～45 d奶牛乳樣進行硫酸銅法檢測懷孕和未懷孕的奶牛檢出率均達到60%以上。

2.3血小板計數(shù)法血小板活化因子是指在母畜受孕后的受精卵，特別是在桑葚胚階段產(chǎn)生的一種乙?；母视土字?。血小板活化因子能夠引起不依賴于能量物質的釋放，而產(chǎn)生血小板的凝集。處于胚胎階段的血小板活化因子能夠接到妊娠的母畜對胚胎的識別，并引起妊娠最初的反應，即血小板的減少。

以往的研究證實：配種7 d后懷孕的母牛血小板數(shù)量明顯減少，而未妊娠的奶牛則沒有明顯的血小板數(shù)量變化[10]。在母牛配種前后根據(jù)血小板的數(shù)量變化，馬群山等[11]對198頭配種7～20 d的奶牛進行血小板數(shù)量的檢測并將結果與配種后50d左右的直檢結果進行比較，結果顯示血小板計數(shù)法對懷孕和未懷孕的奶牛檢出率分別達到81%和90%。

2.4血清酸滴定法懷孕母牛在妊娠過程中，在機體內(nèi)會產(chǎn)生某種特有的在酸性環(huán)境中與其他蛋白質形成低溶性復合物的免疫球蛋白。據(jù)以往報道顯示：利用血清素滴定法對該種免疫球蛋白的檢測，能夠達到對奶牛進行早期孕檢的目的。1994年安翠華等[12]利用血清酸滴定法對配種后16～45 d的奶牛進行該免疫球蛋白的檢測，結果證實利用該種免疫球蛋白進行早期妊娠診斷的準確率高達96%。2007年鄭毛亮等[13]也對經(jīng)配種后16～45 d的89頭奶牛血清樣品利用該方法進行檢測，并與直腸檢測結果比對，對未妊娠和妊娠的奶牛檢出率分別達到了91%和89%。

2.5乳膠凝集抑制試驗該檢測方法屬于一種免疫測定法。當精子和卵子結合轉變?yōu)楹献雍?，在母畜機體內(nèi)發(fā)育為胚胎和胎盤，胚泡的絨毛膜滋養(yǎng)層細胞與胚盤的子葉均分泌類絨毛膜促性腺激素并隨乳汁或黏液排出體外。對妊娠母畜的尿液和乳汁中該激素進行乳膠凝集抑制試驗的檢測，可以作為一種早期妊娠診斷的方法。凌志忠等[14]于1992年對兩批奶牛進行乳膠凝集抑制試驗（檢測奶牛為配種后21～30 d），二批樣品的受孕與空懷的準確率均超過86%。但1998年欒曉峰等[15]對妊娠4～8月的奶牛進行檢測，均呈現(xiàn)陰性，結果表明依靠對類絨毛膜促性腺激素的檢測方法準確性有待提高。

2.6宮頸--陰道黏液電導率測定法Aizinbudas等于1962即提出過利用電機插入奶牛陰道腔測定宮頸和陰道黏液電阻值或電導率，此后許多學者對該方法測定奶牛早期發(fā)情和妊娠診斷的可行性進行了分析。殷國榮等于1992年利用該方法對94頭奶牛進行測定，結果表明，在妊娠早期和發(fā)情周期宮頸-陰道黏液的電導率呈現(xiàn)規(guī)律性變化。處于發(fā)情間期的健康母牛，該電導率處于低水平狀態(tài)，從前情期開始至發(fā)情期逐漸上升，在發(fā)情后期開始下降至發(fā)情間期的水平；在發(fā)情期進行輸精后，妊娠與空懷母牛的電導率變化規(guī)律具有明顯不同。在發(fā)情周期的每一個階段，妊娠母牛電導率明顯低于未妊娠母牛，尤其是在輸精21 d左右。研究顯示進行人工授精后18～24 d的妊娠和空懷奶牛的電導率差異極顯著，且對妊娠和未妊娠奶牛的檢出率分別達到87%和93%[16]。當前，對母牛發(fā)情及早期妊娠的診斷儀主要使用MFR-1和CVMEC-A這兩種型號，該診斷儀主要由主機、探測電極兩部分組成，在臨床使用中需將主機跨于胸前，而探測電極插入待檢母牛的陰道穹窿部粘液中，之后工作人員讀取電導率結果值，即可判定。

2.7堿性磷酸酶活力測定法堿性磷酸酶是一組酶類的總稱，主要分布于小腸黏膜、肝臟、腎臟、骨和胎盤等組織器官中。許多報道證實：在母畜妊娠的桑葚胚階段，體積較大且分裂較慢的細胞中含有堿性磷酸酶；胎盤也隨著妊娠的進展而分泌該酶。以往的研究顯示，在妊娠的母畜血液中堿性磷酸酶活力比未妊娠母牛高，通過測定該酶的活力將其作為妊娠檢測的指標。伍先淑等[17]于1993年采集了發(fā)情期配種前的34頭奶牛血液和36頭配種后連續(xù)3個月且每月定時采集的3次血液樣品，采用甘油磷酸法，利用分光光度計對血液樣品進行堿性磷酸酶的測定，結果顯示，在母牛妊娠第1個月，血清中的堿性磷酸酶活力有所增高，但與未妊娠奶牛相比差異不顯著，至妊娠第2和第3個月時，二組差異顯著且妊娠奶牛堿性磷酸酶活力明顯逐月增高。

2.8放射免疫測定法放射免疫測定法（RIA）是將免疫反應原理與同位素的放射測量法相結合的微量分析方法。Laing等[18]首次在1971年提出利用此方法測定奶牛乳汁中的孕酮含量，以此對奶牛發(fā)情階段和妊娠情況評估，并與直檢結果相一致。祁生旺等[19]1994年分別對10頭妊娠和10頭處于發(fā)情期的奶牛乳汁中孕酮含量檢測，結果顯示妊娠母牛孕酮含量明顯高于發(fā)情期的奶牛且差異顯著。史遠剛等[20]1996年對配種后22～24 d的奶牛進行檢測，結果顯示對未妊娠奶牛的檢出率為100%，妊娠奶牛的檢出率也達到了92%。蔡志強等[21]2001年通過孕酮單克隆抗體建立的孕酮包被固相RIA分析法，對配種后21～58 d的奶牛乳汁或血液樣品進行孕酮含量的測定，結果顯示孕酮含量對判定妊娠和空懷奶牛的診斷率均達到了90%～95%。Haffman等研究表明，奶牛乳汁中和血液中的孕酮濃度是平行的，但乳汁中孕酮含量比血液中高，同時由于乳汁容易采集，所以大部分的研究均采用奶牛的乳汁樣品進行孕酮濃度的測定。RIA法具有較高的精確度和靈敏度，應用該方法對不同階段的奶牛進行孕酮濃度測定的相關研究很多，但由于設備昂貴、技術要求高且具有放射危害等原因，在某種程度上限制了該技術的臨床推廣和應用。

2.9酶聯(lián)免疫吸附測定法近年來，許多研究人員利用酶標記技術對孕酮進行標記后，觀察底物的顏色反應或利用紫外分光光度計、酶標儀等儀器測定孕酮濃度。1987年石放雄等[22]對101頭配種20～22 d的奶牛利用固相微滴板ELISA分析法測定孕酮濃度，檢測結果顯示妊娠和未妊娠檢出率分別為92%和97%。郭大智[23]和楊國林等[24]分別建立了可目視的ELISA吸附法測定孕酮的技術，但楊國林等對人工授精后19～23 d的126頭奶牛妊娠檢出率僅為79%，而郭大智對112頭奶牛早孕的檢出率為100%，說明該技術存在一定的不穩(wěn)定性。

2.10膠體金技術測定法萬華生物工程有限公司（北京）制備了以小分子半抗原為決定簇的孕酮單克隆抗體，對奶牛孕酮含量的測定技術的發(fā)展提供了一定的基礎。萬積成等[25]于2007年在此基礎上，選用膠體金雙抗夾心法，將特異性的單克隆抗體結合至孕酮的位點，利用膠體金的顯色效果，判斷孕酮的含量，對1 559頭配種22～26 d的奶牛乳汁中的孕酮含量進行測定，并結合直檢結果，證明該技術對妊娠和空懷的總檢出率達到95%以上，但該研究未進行交叉驗證等后期驗證性試驗。

3 小結

綜上所述，國內(nèi)外針對奶牛的早期妊娠診斷進行了許多方面的研究，有些方法仍處于研究的初級階段，其結果的可靠性和準備性有待進一步進行驗證，而有些方法因受多種因素的限制無法廣泛而有效地應用于生產(chǎn)實踐中。隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展與進步，奶牛早期妊娠診斷技術也逐步轉變的快速、準確、方便和經(jīng)濟。

[1]舒適.奶牛乳熱血漿差異表達蛋白的分離鑒定及其生物信息學分析[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學，2013.

[2]楊國林，齊光紅.用乳汁孕酮快速檢測法進行乳牛早期妊娠診斷[J].中國獸醫(yī)科技，1998，28（1）：29-30.

[3]鄭星道，吳延春，魏素華，等.SCD—Ⅱ型獸醫(yī)用超聲多普勒檢測儀對乳牛早期懷孕診斷的試驗研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，1988（4）：39-42.

[4]鄭星道，吳延春.應用超聲多普勒檢測儀對乳牛早期懷孕診斷試驗[J].中國農(nóng)業(yè)科學，1990，23（3）：80-84.

[5]鄧干臻，李成葉，高斌章，等.奶牛妊娠的早期診斷——實時B超法[J].中國獸醫(yī)學報，2004，24（6）：94-595.

[6]Koch E,Morton H,Ellendorf F.Early pregnancy factor:biology and practical application [review, livestock and laboratory mammals] [J].British Veterinary Journal,1983,139.

[7]李雅茹，劉緒川，張國偉.應用玫瑰花抑制試驗診斷奶牛早期妊娠的研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1988，4：2-8.

[8]王應安，宋維文.硫酸銅法對奶牛早期妊娠診斷的研究[J].青海畜牧獸醫(yī)學院學報，1996，13（2）：32-34.

[9]何勇軍，張綺瓊，朱錦蘭.奶牛早期妊娠診斷幾種方法的比較[J].中國奶牛，2001，5：22.

[10]李助南，唐登華，郭良輝.血小板計數(shù)法對奶牛超早期妊娠的診斷研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005，9：9.

[11]馬群山，唐德江.血小板活化因子與母畜妊娠關系的探討[J].河南畜牧獸醫(yī)，2000，21（6）：6-7.

[12]安翠花，王德山.血清酸滴定法對奶牛進行早期妊娠診斷的研究報告[J].當代畜牧，1994，1：32.

[13]鄭毛亮，廖秋萍，陳樹林，等.用血清酸滴定法對牛進行早期妊娠診斷的研究[J].動物醫(yī)學進展，2007，28（6）：46-49.

[14]凌志忠，李大鐵，陳韶讓.LAIT技術對牛孕檢的初步研究[J].中國獸醫(yī)雜志，1992，18（8）：15-16.

[15]欒曉峰，葛利江.hCG試紙對奶牛妊娠檢測的觀察[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，1998，23（2）：12-14.

[16]殷國榮，王建軍，楊建一，等.母牛發(fā)情周期和妊娠早期宮頸-陰道粘液電導率變化規(guī)律的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，1992，25（4）：77-81.

[17]伍先淑，賀集祿，曾明亮，等.測定血清堿性磷酸酶（AKP）活力變化作為奶牛早期妊娠診斷法的探討[J].中國獸醫(yī)雜志，1993，19（4）：17-18.

[18]Laing J A,Heap R B.The concentration of progesterone in the milk of cows during the reproductive cycle[J]. The British veterinary journal,1971,127(8):xix.

[19]祁生旺，黃祖干，劉俊平，等.懷孕奶牛和發(fā)情期奶牛乳汁中孕酮的檢查[J].內(nèi)蒙古農(nóng)牧學院學報，1994，15（1）：62-64.

[20]史遠剛，吳穎慧，周樂，等.奶牛早孕診斷乳汁孕酮臨界值的確定[J].黃牛雜志，1996，（4）：24-27.

[21]蔡志強，徐寧迎，徐步進，等.孕酮固相放免法的建立及其應用初探[J].中國畜牧雜志，2001，37（5）：18-19.

[22]石放雄，吳蘭生.牛奶孕酮的酶免疫分析法及其臨床應用[J].浙江農(nóng)業(yè)大學學報，1987，13（1）：13-21.

[23]郭大智.奶牛早孕現(xiàn)場快速簡易診斷方法[J].中國奶牛，1996，（1）：53-55.

[24]楊國林，熊三友，牛建榮，等.目視ELISA測定孕酮的研究及其應用[J].中國獸醫(yī)科技，1998，28（8）：28-29.

[25]萬積成，萬志靜，唐曉賓，等.奶牛早孕診斷試紙條的研制及臨床試驗[J].中國奶牛，2007，（12）：22-25.

Advance of Early Pregnancy Diagnosis Technology in Dairy Cows

Bao Kai1,Cao yu1,Liu Guanglei1*,An Pengpeng2, Sun Xianzhi1,Huang Jian1,Li Fuquan1
(1.Shanghai dairycow breeding center Co.,Ltd.,Shanghai 200436; 2.Collge of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Early pregnancy diagnosis has been a problem to be solved in dairy cow.In recent years,with the rapid development of dairy industry,early pregnancy diagnosis has been had more impacts on the development of dairy cows.A simple and efficient technique for early pregnancy diagnosis is of great significance to improve dairy cattle breeding and is the basic requirement for farm management and economic benefits.This paper summarized the clinical application of early pregnancy diagnosis in order to provide a theoretical basis for the future study of early pregnancy diagnosis.

Dairy cows;Early pregnancy diagnosis;Breeding efficiency;Economic efficiency

S857.21 < class="emphasis_bold"> 文獻標識碼：A

A

1672-9692(2016)08-0049-04

2016-05-20

包凱（1986-），男，碩士，臨床獸醫(yī)學。

劉光磊（1979-），男，高級畜牧師。