骨組織工程研究現(xiàn)狀及臨床應用*

馮剛　肖東琴

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000)

?

·專家述評·

骨組織工程研究現(xiàn)狀及臨床應用*

馮剛肖東琴

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000)

自20世紀80年代提出組織工程的概念以來，骨組織工程在基礎研究方面取得了巨大進展。但要正式大規(guī)模應用于臨床還存在許多困難和挑戰(zhàn)。本文主要從支架材料、種子細胞、組織構建及臨床初步應用四方面對骨組織工程的基礎研究現(xiàn)狀及臨床應用做一述評，期望骨組織工程的發(fā)展將推動組織工程骨產品的臨床應用，并造福廣大患者。

骨組織工程；支架；種子細胞；臨床應用

執(zhí)行編委簡介：馮剛，男，醫(yī)學博士，南充市中心醫(yī)院副院長，《西部醫(yī)學》副主編。川北醫(yī)學院組織工程與干細胞研究所、南充市中心醫(yī)院生物治療中心主任，教授，碩士生導師。四川省“千人計劃”特聘專家，四川省學術和技術帶頭人，四川省杰出青年學科帶頭人資助人選，四川省醫(yī)學會骨科專委會委員。主要從事骨及軟骨組織工程，椎間盤退行性變疾病的生物治療及腫瘤生物治療等研究。主持國家“973”項目子課題1項、國家自然科學基金項目4項、軍隊“九五”和“十五”重點課題以及省部級科研課題多項。先后獲得軍隊科技進步二等獎、四川省醫(yī)學科技獎二等獎、南充市科技進步一等獎、二等獎各1項。在國內外發(fā)表學術論文80余篇，申請國家發(fā)明專利3項。E-mail：genecloner@163.com

隨著社會經濟發(fā)展以及車輛的迅猛增長，創(chuàng)傷、感染、腫瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺損尤其是大段骨缺損(內徑>5 mm)，使人們對骨修復體的需求量呈現(xiàn)快速增長。目前，自體骨移植作為骨缺損修復的金標準，至今仍是臨床最常用及最有效的骨修復方法。由于其來源及二次手術等問題，限制了大規(guī)模應用，同種異體骨和異種同體骨的使用也存在免疫排斥及病原傳染等危險。因此，骨組織工程應運而生，其利用組織工程技術體外構建或在體移植具有生物學功能的組織工程骨，為骨缺損患者帶來新的希望，是目前公認用于大段骨缺損修復的理想方法。因骨組織結構、功能相對簡單，在組織工程領域發(fā)展最為迅速，被認為是目前最快能獲得實際應用的領域[1]。近20余年來隨著人們對支架材料、種子細胞、組織構建及臨床初步應用研究的深入，出現(xiàn)了一系列可喜的研究成果。本文就國內外骨組織工程的研究現(xiàn)狀及臨床應用作一述評。

1　骨組織工程支架材料的研究

體外構建組織工程骨過程中，支架材料作為細胞外基質替代物，起著引導細胞生長、血管長入及營養(yǎng)物質傳輸?shù)闹匾饔?，也是支撐細胞遷移生長形成立體組織的關鍵所在。理想的骨移植支架材料應具有三維貫通多孔結構，良好的生物相容性、生物降解性能及適宜的機械強度。目前，在骨組織工程中研究較多的支架材料主要有天然支架材料、人工合成的支架材料以及復合材料。

天然生物衍生材料如膠原、藻酸鹽及殼聚糖等，具有良好的生物相容性，是較為理想的細胞外基質替代材料[2-4]。因力學強度差及降解速度難以控制等缺點，使其單獨作為支架材料的前景不佳。此外，對異體骨經過脫脂、脫礦、消毒及凍干等處理獲得的脫鈣骨基質，保留了骨優(yōu)良的立體多孔結構，具有良好的骨誘導性及骨傳導性，為種子細胞的黏附、生長提供了良好的生長環(huán)境，臨床常與成骨活性物質復合移植到病人體內[5]。但經過脫礦處理，造成機械強度下降，其免疫原性仍是難以克服的問題。

采用物理化學方法合成的人工支架材料，來源廣泛，能夠有效避免天然支架材料存在的免疫原及傳播潛在性疾病的風險。人工高分子材料以聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物均具有良好的可塑性且降解速率可控[6]，但表面缺乏細胞識別信號，體內降解產物易誘發(fā)炎癥反應及力學強度不足等問題，使其不能成為理想的骨組織工程支架材料。而人工合成的無機非金屬材料，以羥基磷灰石和磷酸三鈣陶瓷材料應用最為廣泛[7-8]。羥基磷灰石作為人體硬組織的主要無機成分，因其良好的生物相容性和骨傳導性被廣泛應用于骨缺損和牙科修補。但其脆性大、難降解，導致其單獨使用受到限制。而磷酸三鈣也存在機械強度差、降解速率過快等問題。此外，不銹鋼和鈦合金等作為骨科臨床常用的金屬材料，不能降解，需要二次手術取出，且較高的彈性模量產生應力屏蔽，易導致骨質疏松等并發(fā)癥的發(fā)生。而鎂作為可降解金屬材料，重量輕、密度小，其彈性模量(45 GPa)更接近于正常骨組織，且無需二次手術，這些特性使鎂及其合金成為極有應用前景的新型骨組織工程材料。然而其體內降解速率過快，產生大量氫氣，導致體內研究的失敗[9]。因此，對鎂進行改性，調控鎂的降解速率使其與骨組織生長速率相匹配是目前研究的熱點。Fischerauer等采用微弧氧化的方法對鎂支架進行改性，植入動物體內一周后，幾乎未見鎂支架降解，支架與周圍組織結合良好[10]。但三周后發(fā)現(xiàn)支架與未改性支架相比，降解速率加快。微弧改性的方法雖然延緩了支架起始的降解速率，但支架比表面積的增大也加速了后期支架的降解。

鑒于單一類型支架材料存在各自的缺陷，不能滿足骨缺損修復的需求，因此，結合不同類型材料的優(yōu)勢，開發(fā)復合材料用于骨組織工程勢在必行。目前，常用的復合材料主要有生物陶瓷材料的復合、生物陶瓷與高分子材料的復合、金屬與陶瓷材料的復合以及金屬與高分子材料的復合等。其中結合羥基磷灰石良好的生物活性及β-磷酸鈣三鈣吸收降解性能合成的雙相磷酸鈣(BCP)骨修復生物陶瓷作為商業(yè)化產品在美國、日本及歐洲等國家得到廣泛應用[11]。多孔BCP生物陶瓷作為骨組織工程支架可通過調節(jié)HA/β-TCP比例控制降解速率，使材料的降解速率與組織細胞生長速率相適應，且其降解產物鈣、磷離子的釋放有利于類骨磷灰石的沉積，促進新骨形成,且能與骨組織形成化學鍵合。此外，將羥基磷灰石與鎂支架結合，在鎂支架表面制備羥基磷灰石涂層，既能發(fā)揮磷酸鈣的骨傳導能力，又克服了單一陶瓷材料韌性差，不能用于承重部位的缺陷，又能延緩單純鎂支架降解過快的問題[12]。同樣，將高分子和陶瓷材料復合制備多孔支架，有利于提高支架的機械性能，增強生物活性并減少高分子材料降解造成的副反應[13-14]。

隨著人們對組織工程支架材料研究的深入，發(fā)現(xiàn)理想的組織工程材料除了提供支撐作用外，還應具備利用自身的表面結構和化學性能為細胞提供力學及生物學信號，達到調控細胞行為的功能。生物材料的表面硬度、微納米結構、孔徑尺寸及化學成分等都決定著材料表面的理化性質，也影響著相關蛋白質的吸附行為[15]，進而影響細胞的免疫調節(jié)能力及成骨能力[16]。清華大學的崔福齋組通過自組裝制備了與天然骨成分及納米結構相似的納米晶羥基磷灰石/膠原的骨修復產品“骼金”[17]，獲得美國食品和藥品管理局認證并應用于臨床，效果良好。因此，通過改變支架材料的表面特性來調節(jié)細胞生長行為，開發(fā)具有細胞響應功能的支架材料將是骨組織工程學研究的主要方向。

2　骨組織工程種子細胞的研究

生物支架只有在種植特定種子細胞且細胞在支架上正常生長和發(fā)揮其生物學功能，才能完成真正意義上的組織工程構建。要獲取合適的種子細胞應用于臨床，需滿足以下要求：①具有良好的擴增能力和成骨分化潛能。②植入體內不引起免疫反應和致瘤。目前，臨床上廣泛使用的自體種子細胞主要是經病人髂骨穿刺，從骨髓中分離提取出來的骨髓間充質干細胞(BMSCs)，具有良好的成骨分化潛能，移植后生物安全性高，被認為是最有潛力的種子細胞。但缺點在于BMSCs的獲取會造成供區(qū)損傷，且骨髓中含量稀少。其體外增殖能力有限，擴增能力會隨患者年齡增加而降低。因此，國內外學者對別的干細胞進行了大量研究，試圖尋找更為合適的種子細胞。胚胎干細胞屬于全能干細胞，具有多向分化潛能和無限增殖的能力，理論上是用于骨組織工程種子細胞的最佳選擇。而胚胎干細胞面臨的倫理學爭論和異體排斥反應的障礙，使其來源與臨床應用受到極大限制。此外，近年從骨外組織中如脂肪、皮膚和外周血等組織中分離出的MSCs，在誘導因子作用下能定向分化為成骨細胞[18-19]。與BMSCs相比，這些骨外組織中的干細胞獲取更為容易且對供體造成損傷更小。但它們均為成體干細胞，不具備無限增殖及分化潛能，仍存在擴增能力隨年齡增加而降低的問題。且此類研究尚在起步階段，其成骨效果和機制還有待進一步研究。

鑒于種子細胞增殖能力和免疫原性無法協(xié)調統(tǒng)一的問題，人們通過基因技術改變細胞性能使其達到兩者的統(tǒng)一。Takahashi等于2006年首次報道利用病毒載體將四個轉錄因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)導入小鼠成纖維細胞中，獲得類似胚胎干細胞樣，具有全能分化潛能的誘導多能干細胞(iPSCs)，并在人的體細胞中獲得成功[20]。這種方法既增強了自體細胞的增殖分化潛能，又解決了異體排斥反應的問題，這預示著iPSCs應用于骨組織工程的巨大潛能。但此方法涉及逆轉錄病毒的使用以及原癌基因c-Myc和Klf4的使用，存在致瘤的風險。因此，研究者從載體類型和重編程因子的篩選等方面進行大量研究，以此來降低致瘤可能性，并取得了可喜的成果[21-22]。另外，針對異體細胞，研究者通過基因技術修飾種子細胞，阻斷機體識別信號或使T細胞無法識別從而產生免疫耐受[23]，讓種子細胞能在體外大量增殖又不具備免疫原性，以達到異體移植的目的。

此外，干細胞來源的種子細胞用于構建骨組織工程過程中，為了維持干細胞誘導分化后種子細胞特性，一般需要持續(xù)給予誘導分化因子(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉化生長因子、血管內皮生長因子和血小板衍生生長因子等)的刺激。為了實現(xiàn)誘導因子的持續(xù)表達，目前的研究將誘導因子相關基因通過轉染的方式導入細胞內部，通過細胞增殖的方式實現(xiàn)成骨相關基因的長期表達，從而達到促進成骨的目的[24]，但應用于臨床還需考慮轉染載體的安全性及轉染基因表達效率等問題。

3　骨組織工程構建技術研究

在制備支架材料與獲取種子細胞后，如何高效復合構建組織工程骨是骨組織工程應用于臨床必需解決的問題。目前的構建策略主要有兩種：①體內組織工程技術：即視體內自然生理環(huán)境為生物反應器，將攜載生長因子或復合細胞的多孔支架直接植入體內，在體構建組織工程骨或進行骨缺損原位修復。②體外組織工程技術：利用體外細胞培養(yǎng)技術，將復合生長因子和種子細胞的多孔支架在體外培育，形成工程化骨組織，然后植入體內進行骨組織修復。

對體外組織工程構建而言，以往的研究常將種子細胞直接滴在支架上，進行靜態(tài)培養(yǎng)。此方法僅靠支架孔隙的物理作用將細胞截留在支架上。由于重力作用，細胞往往沉積在支架底部，支架內部或頂部缺乏足夠細胞，且營養(yǎng)代謝受限。結果導致細胞接種率低，體外培育周期長，難以做到組織工程骨規(guī)?；a。因此，為了模擬組織生長體內微環(huán)境，人們開發(fā)了動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，即生物反應器。它能提供體內組織生長所需的動態(tài)環(huán)境，給予細胞應力刺激，增強支架材料內細胞之間的空間接觸，同時加強支架內部營養(yǎng)物質的傳輸及代謝。特別是流動灌注生物反應器的應用，能夠實現(xiàn)在體外直接培育大塊組織工程骨[25]。這預示著生物反應器在組織構建過程中良好的應用前景，但要模擬體內生理環(huán)境，其他控制條件還需進一步研究改善。此外，為了建立組織工程骨培育過程中的血液供應，構建過程往往與血管內皮等細胞聯(lián)合培養(yǎng)或采用顯微外科手段輔助[26]。組織工程能否成功構建是組織工程骨應用于臨床的關鍵環(huán)節(jié)。

4　骨組織工程臨床應用研究

骨組織工程構建的最終目的是應用于臨床實現(xiàn)骨缺損修復。因此，國內外學者在進行骨組織工程基礎研究的同時，也開展了組織工程骨的臨床應用研究。華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室項舟團隊將成骨細胞與生物衍生骨支架材料復合制備的組織工程骨用于修復骨缺損患者52例，并對其中10例進行7年隨訪，發(fā)現(xiàn)組織工程骨植入體內具有良好的成骨能力，長期修復效果良好，未見明顯排斥反應及并發(fā)癥[27]。此外，第三軍醫(yī)大學劉杰等取患者自體BMSCs與同種異體脫鈣骨基質復合，構建個體化組織工程骨用于30例長骨缺損患者，隨訪發(fā)現(xiàn)成骨速度與效果均與自體骨相似，具有良好的成骨效能和生物安全性[28]。國外Sándor等將自體脂肪干細胞種植在磷酸三鈣支架材料上，并復合骨形態(tài)發(fā)生蛋白制備組織工程骨用于原位修復患者前下頜骨缺損[29]。10個月后發(fā)現(xiàn)組織工程骨在缺損處成骨效果良好，表明其在大段下頜骨缺損修復方面具有良好的應用前景。

5　小結與展望

目前，雖然在骨組織工程的基礎研究和臨床應用方面取得了一定進展，但要真正實現(xiàn)組織工程骨臨床應用及產品的產業(yè)化，仍面臨諸多困難。首先，關于種子細胞的來源、保存、運輸及技術流程等具體事宜還缺乏相關的標準；其次，對組織工程產品臨床使用安全性尚無完善的評價方法；此外，支架材料目前在機械性能上還很難完全滿足承重部位的力學要求，構建血管神經化組織工程骨還存在較大困難，還有臨床上骨缺損處常并發(fā)骨感染，而組織工程骨本身并不具備抗感染能力。這些都是骨組織工程從基礎研究向臨床大規(guī)模應用轉變需要解決的關鍵技術問題。總之，骨組織工程的研究應以臨床應用和市場產業(yè)化為指導進行相關基礎研究。我們堅信，通過廣大研究者的共同努力，必將涌現(xiàn)出造福骨缺損患者的組織工程骨產品，真正體現(xiàn)出骨組織工程重大的社會意義和經濟價值。

[1]崔福齋. 骨組織工程的發(fā)展趨勢[J]. 中國醫(yī)療器械信息, 2010, 16(2): 16-21.

[2]Ferreira A M, Gentile P, Chiono V,etal. Collagen for bone tissue regeneration[J]. Acta Biomaterialia, 2012, 8(9): 3191-3200.

[3]Moshaverinia A, Chen C, Xu X,etal. Bone regeneration potential of stem cells derived from periodontal ligament or gingival tissue sources encapsulated in RGD-modified alginate scaffold[J]. Tissue Engineering Part A, 2013, 20(3-4): 611-621.

[4]Nandi SK, Kundu B, Basu D. Protein growth factors loaded highly porous chitosan scaffold: A comparison of bone healing properties[J]. Materials Science and Engineering: C, 2013, 33(3): 1267-1275.

[5]陳海霞, 謝志剛. 骨組織工程支架材料: 脫礦骨基質[J]. 中國組織工程研究, 2014, 18(3): 426-431.

[6]Gentile P, Chiono V, Carmagnola I,etal. An overview of poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(3): 3640-3659.

[7]Tripathi G, Basu B. A porous hydroxyapatite scaffold for bone tissue engineering: Physico-mechanical and biological evaluations[J]. Ceramics International, 2012, 38(1): 341-349.

[8]Miyaji H, Yokoyama H, Kosen Y,etal. Bone augmentation in rat by highly porous β-TCP scaffolds with different open-cell sizes in combination with fibroblast growth factor-2[J]. Journal of Oral Tissue Engineering, 2013, 10(3): 172-181.

[9]Kraus T, Fischerauer SF, H?nzi AC,etal. Magnesium alloys for temporary implants in osteosynthesis: in vivo studies of their degradation and interaction with bone[J]. Acta Biomaterialia, 2012, 8(3): 1230-1238.

[10] Fischerauer SF, Kraus T, Wu X,etal. In vivo degradation performance of micro-arc-oxidized magnesium implants: a micro-CT study in rats[J]. Acta Biomaterialia, 2013, 9(2): 5411-5420.

[11] Daculsi G, Laboux O, Malard O,etal. Current state of the art of biphasic calcium phosphate bioceramics[J]. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2003, 14(3): 195-200.

[12] Kim SM, Jo JH, Lee SM,etal. Hydroxyapatite-coated magnesium implants with improved in vitro and in vivo biocorrosion, biocompatibility, and bone response[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2014, 102(2): 429-441.

[13] Torres AL, Gaspar VM, Serra IR,etal. Bioactive polymeric-ceramic hybrid 3D scaffold for application in bone tissue regeneration[J]. Materials Science and Engineering: C, 2013, 33(7): 4460-4469.

[14] Tayton E, Purcell M, Aarvold A,etal. A comparison of polymer and polymer-hydroxyapatite composite tissue engineered scaffolds for use in bone regeneration. An in vitro and in vivo study[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2014, 102(8): 2613-2624.

[15] Xiao D, Zhou X, Li H,etal. Fabrication of hollow hydroxyapatite particles assisted by small organic molecule and effect of microstructure on protein adsorption[J]. Journal of the European Ceramic Society, 2015, 35(6): 1971-1978.

[16] Kim MH. Modulation of innate immune response for tissue engineering[M]//Biomedical Engineering: Frontier Research and Converging Technologies. Springer International Publishing, 2016: 157-174.

[17] Synthetic bone. Nature Materials 2003; 2: 566-566.

[18] Al-Nbaheen M, Ali D, Bouslimi A,etal. Human stromal (mesenchymal) stem cells from bone marrow, adipose tissue and skin exhibit differences in molecular phenotype and differentiation potential[J]. Stem Cell Reviews and Reports, 2013, 9(1): 32-43.

[19] Chong PP, Selvaratnam L, Abbas AA,etal. Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. Journal of Orthopaedic Research, 2012, 30(4): 634-642.

[20] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell, 2006, 126(4): 663-676.

[21] Huangfu D, Osafune K, Maehr R,etal. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2[J]. Nature Biotechnology, 2008, 26(11): 1269-1275.

[22] Yu J, Hu K, Smuga-Otto K,etal. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences[J]. Science, 2009, 324(5928): 797-801.

[23] Dai F, Shi D, He W,etal. hCTLA4-gene modified human bone marrow-derived mesenchymal stem cells as allogeneic seed cells in bone tissue engineering[J]. Tissue Engineering, 2006, 12(9): 2583-2590.

[24] Luo XW, Liu K, Che Z,etal. An experimental study of adenovirus-mediated growth and differentiation factor-5 promoting the extracellular matrix expression in nucleus pulposus cells of a degenerative intervertebral disc[J]. Journal of Zhejiang University Science B, 2016, 17(1):30-42.

[25] Gardel LS, Correia-Gomes C, Serra LA,etal. A novel bidirectional continuous perfusion bioreactor for the culture of large-sized bone tissue-engineered constructs[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2013, 101(8): 1377-1386.

[26] 吳驍偉, 王黔, 曹誼林, 等. 組織工程骨血管化策略的研究進展[J]. 組織工程與重建外科, 2015, 11(5): 331-334.

[27] 彭鯤, 項舟, 楊志明. 組織工程骨植骨臨床應用七年隨訪結果[J]. 中國修復重建外科雜志, 2008, 22(5): 606-609.

[28] 劉杰, 吳雪暉, 羅飛, 等. 自體間充質干細胞構建組織工程骨修復人長骨缺損的臨床觀察[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2008, 30(9): 851-854.

[29] Sándor GK, Tuovinen VJ, Wolff J,etal. Adipose stem cell tissue-engineered construct used to treat large anterior mandibular defect: a case report and review of the clinical application of good manufacturing practice-level adipose stem cells for bone regeneration[J]. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2013, 71(5): 938-950.

Research status and clinical application of bone tissue engineering

FENG Gang,XIAO Dongqin

(ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCells,TheSecondClinicalInstituteofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

Bone tissue engineering has made significant progress in the basic research since the concept of tissue engineering was proposed in the 1980s. However, there are still many difficulties and challenges in large-scale clinical application for bone tissue engineering. In this paper, a comment on basic status and clinical application was elaborated from the four aspects of scaffold materials, seeded cells, tissue construct and preliminary clinical application, respectively. It is expected that the advancement of bone tissue engineering would promote the clinical application of tissue-engineered bone and benefit patients.

Bone tissue engineering; Scaffold; Seed cells; Clinical application

國家自然科學基金(81171472、81201407)；四川省科技廳應用基礎項目(2016JY0123)；四川省教育廳創(chuàng)新團隊資助項目(13TD0030)；四川教育廳重大培育項目(15CZ0021)

R 318.08

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.002

2016-04-01； 編輯： 張文秀)