快速振蕩法高效提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞研究

徐尤年，劉桂林，蒙 臣，張?jiān)姾?/p>

·論著·

快速振蕩法高效提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞研究

徐尤年，劉桂林，蒙 臣，張?jiān)姾?/p>

【摘要】目的通過(guò)與傳統(tǒng)的腹腔巨噬細(xì)胞提取方法——輕揉法進(jìn)行比較，建立一種高效提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法——快速振蕩法。方法2014年11月選取雄性健康SPF級(jí)C57bl/6小鼠20只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為輕揉組和振蕩組，各10只。分別采用傳統(tǒng)的腹部輕揉法和快速振蕩法提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡率，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果兩組小鼠體質(zhì)量和腹腔灌洗液回收率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。輕揉組巨噬細(xì)胞凋亡率為(5.44±0.08)%，振蕩組巨噬細(xì)胞凋亡率為(5.60±0.12)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.09，P=0.29)。振蕩組細(xì)胞總數(shù)〔(5.69±0.23)×106與(3.82±0.12)×106〕和巨噬細(xì)胞總數(shù)〔(2.64±0.08)×106與(1.66±0.07)×106〕均多于輕揉組(P<0.05)。結(jié)論快速振蕩法提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞凋亡率無(wú)增加，細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞總數(shù)明顯增加，是一種更加高效的提取腹腔巨噬細(xì)胞的方法。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，體內(nèi)分布廣泛，在抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用[1-2]，也是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。與傳代細(xì)胞相比，原代細(xì)胞與體內(nèi)組織更接近，形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)更相似[3]，因此備受科研工作者們關(guān)注。但如何從這些組織器官中分離、純化獲得高純度、高活性的巨噬細(xì)胞，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞提取方法是體外細(xì)胞培養(yǎng)研究工作者的首要任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，建立一種高效提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法——快速振蕩法。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器含3%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)，Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/ 碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BioLegend公司)，抗小鼠FITC-F4/80流式抗體(BioLegend 公司)，1 ml移液器，5 ml注射器，顯微鏡(Olympus SZ51，日本)，離心機(jī)(測(cè)維光電TG16A-WS，上海)，流式細(xì)胞儀(BD influxTM，美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2014年11月選取雄性健康SPF級(jí)C57bl/6小鼠20只，8周齡，體質(zhì)量20～24 g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離、檢測(cè)將小鼠摘眼球放血后以頸椎脫臼法處死，采用70%乙醇溶液消毒小鼠腹部皮膚，然后讓其呈仰臥位四肢展開(kāi)，固定于解剖板上，無(wú)菌條件下打開(kāi)小鼠腹腔，用眼科鑷提起下腹皮膚，剪一小口，并沿腹中線剪開(kāi)3～5 cm長(zhǎng)的腹部皮膚，上至頸部，充分暴露腹膜。取5 ml注射器，向腹腔注射4 ml PBS和1 ml空氣。注意進(jìn)針勿過(guò)深，不要損傷內(nèi)臟及血管。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為兩組。輕揉組10只：采用5 ml注射器吸取腹腔內(nèi)4 ml的PBS，輕揉腹部2 min，靜置5 min后用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。然后用鑷子提起腹膜，在腹膜上剪一小口，再用1 ml移液器取PBS 1 ml重復(fù)灌洗2次。將3次回收的腹腔灌洗液置于離心管。振蕩組10只：用5 ml注射器吸取4 ml PBS和1 ml空氣注入腹腔，右手拿起解剖板，快速水平振蕩2 min(約100次)，用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。然后用鑷子提起腹膜，在腹膜上剪一小口，再用1 ml移液器取PBS 1 ml重復(fù)灌洗2次。將3次回收的腹腔灌洗液置于離心管。計(jì)算腹腔灌洗液回收率：記錄每只小鼠3次腹腔灌洗液的總體積，除以總量3 ml。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

作為一種免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在病原微生物清除、炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，也是研究細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。但如何提取高純度的原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)是困擾研究者們的一個(gè)難題，輕揉法是提取原代巨噬細(xì)胞最常用的方法。根據(jù)巨噬細(xì)胞易黏附、貼壁的特點(diǎn)，本研究提出振蕩法這一新的提取巨噬細(xì)胞的方法，跟傳統(tǒng)的輕揉法進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，振蕩法可以獲取更多的巨噬細(xì)胞，從而為科研工作者獲取原代巨噬細(xì)胞提供新的方法。

1.4細(xì)胞凋亡分析參照流式細(xì)胞儀試劑盒操作規(guī)范，4 ℃，300×g離心5 min，收集5×105個(gè)細(xì)胞，重懸細(xì)胞后，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻，避光、室溫反應(yīng)10 min。樣品在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡率。

1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)4 ℃，400×g離心6 min，所得細(xì)胞沉淀用PBS重懸，充分混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。

1.6巨噬細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參照本課題組前期的方法[4]進(jìn)行巨噬細(xì)胞流式標(biāo)記檢測(cè)。腹腔灌洗細(xì)胞(1×106個(gè)) 懸液100 μl中，加入抗小鼠 FITC-F4/80抗體0.5 μl，室溫避光作用 40 min，用2 ml PBS 混勻，400×g離心5 min，棄去上清液，加入200 μl PBS，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞總數(shù)。

2結(jié)果

2.1兩組小鼠體質(zhì)量和腹腔灌洗液回收率比較兩組小鼠體質(zhì)量和腹腔灌洗液回收率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

Table 1Comparison of body mass and the recovery rate of peritoneal lavage fluids between the two groups

組別只數(shù)體質(zhì)量(g)灌洗液回收率(%)輕揉組1022.1±0.582.89±1.13振蕩組1022.5±0.583.19±0.96t值0.130.20P值0.930.64

2.2兩組巨噬細(xì)胞凋亡率比較輕揉組巨噬細(xì)胞凋亡率為(5.44±0.08)%，振蕩組巨噬細(xì)胞凋亡率為(5.60±0.12)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.09，P=0.29，見(jiàn)圖1)。

2.3兩組細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞總數(shù)比較輕揉組細(xì)胞總數(shù)為(3.82±0.12)×106，振蕩組細(xì)胞總數(shù)為(5.69±0.23)×106，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.39，P<0.001)。輕揉組巨噬細(xì)胞總數(shù)為(1.66±0.07)×106，振蕩組巨噬細(xì)胞總數(shù)為(2.64±0.08)×106，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.56，P<0.001，見(jiàn)圖2)。

3討論

本課題組在提取腹腔巨噬細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞貼壁性很強(qiáng)，參照傳統(tǒng)的輕揉法[5-6]提取的腹腔細(xì)胞數(shù)量少，巨噬細(xì)胞比例低，并且需要靜置5～7 min，甚至更長(zhǎng)時(shí)間。本課題組經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，提出快速振蕩法，提高了巨噬細(xì)胞的提取率，提取的巨噬細(xì)胞活力與傳統(tǒng)的方法相似，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，方便了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

注：FITC=異硫氰酸熒光素，PI=碘化丙啶

圖1Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡率

Figure 1Apoptosis rate of macrophages apoptosis detected by Annexin V-FITC/PI FCM

圖2　兩組小鼠分離細(xì)胞

目前，腹腔巨噬細(xì)胞可以直接提取，也可以先在腹腔注入巨噬細(xì)胞刺激劑(如肉湯、淀粉、蛋白胨等)[7-8]，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入腹腔，從而提高巨噬細(xì)胞的獲取數(shù)量。雖然此法能收集到大量的腹腔巨噬細(xì)胞，但獲得的腹腔巨噬細(xì)胞與原體內(nèi)巨噬細(xì)胞相比，功能基礎(chǔ)已經(jīng)發(fā)生了一定程度的變化，因此與這種方法相比，直接提取方法避免了注入的大分子物質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響[6，9]。傳統(tǒng)的直接提取巨噬細(xì)胞的方法就是輕揉法[6，10]。

本研究根據(jù)巨噬細(xì)胞特點(diǎn)提出快速振蕩法，與傳統(tǒng)的輕揉法相比，快速振蕩法提取的腹腔細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞總數(shù)更多。其原因可能是：(1)輕揉法局部刺激了腸道，增加了成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比例。(2)快速振蕩法增大了對(duì)腹腔內(nèi)細(xì)胞的沖刷作用，促使巨噬細(xì)胞游離，因此可以獲取更多的巨噬細(xì)胞。(3)在應(yīng)用快速振蕩法時(shí)腹腔內(nèi)有1 ml的空氣，增加了液體移動(dòng)空間，同時(shí)減少了腹腔灌洗液的外滲和細(xì)胞的丟失，有利于提高液體回收率和細(xì)胞數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，快速振蕩法與輕揉法比較，腹腔灌洗液回收率無(wú)差異，因?yàn)檩p揉法提取腹腔巨噬細(xì)胞的動(dòng)作輕柔，腹腔灌洗液回收率已經(jīng)比較高，腹腔灌洗后部分液體滯留在腹腔臟器間隙，難以完全回收?？焖僬袷幏ㄖ?，1 ml空氣對(duì)快速振蕩法的成功使用至關(guān)重要，如果未注入1 ml空氣，快速振蕩時(shí)壓力的快速變化會(huì)導(dǎo)致腹腔灌洗液的外滲，降低腹腔灌洗液回收率和細(xì)胞數(shù)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，兩組巨噬細(xì)胞凋亡率相似，說(shuō)明快速振蕩法并未對(duì)提取細(xì)胞的存活產(chǎn)生影響。

快速振蕩法提取腹腔巨噬細(xì)胞的過(guò)程中，需要特別注意幾點(diǎn)：(1)頸椎脫臼法處死小鼠之前先摘眼球放血，減少提取的細(xì)胞中紅細(xì)胞的比例，減少紅細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激活化，有利于巨噬細(xì)胞基礎(chǔ)功能的保持和后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。(2)腹腔灌洗時(shí)用4 ml PBS和1 ml空氣注入腹腔，空氣進(jìn)入腹腔后在最上面，減少振蕩過(guò)程中腹腔內(nèi)的液體從注射針孔外溢，提高腹腔灌洗液回收率和細(xì)胞數(shù)。(3)用注射器或者是槍頭在腹腔吸取腹腔灌洗液時(shí)避免對(duì)腹腔內(nèi)臟器的過(guò)度刺激(不要將大小腸吸入移液器槍頭)，減少腹腔灌洗液中的成纖維細(xì)胞(成纖維細(xì)胞也是貼壁細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中貼壁洗滌純化得到巨噬細(xì)胞時(shí)無(wú)法將成纖維細(xì)胞去除，只能去除淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞)。(4)灌洗液中加入3%胎牛血清，或者是直接用RPMI 1640培養(yǎng)基灌洗，一方面可以提高巨噬細(xì)胞的提取數(shù)量，另一方面可提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞活性。

針對(duì)巨噬細(xì)胞貼壁性強(qiáng)的特點(diǎn)，本課題組通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)巨噬細(xì)胞提取方法進(jìn)行改進(jìn)，提出快速振蕩法。該方法簡(jiǎn)單易行，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間(輕揉法要求按摩腹部5 min甚至更長(zhǎng)，導(dǎo)致腹腔臟器水腫，腹腔灌洗液回收率低)，極大提高了腹腔巨噬細(xì)胞的獲取率，方便了科研工作者對(duì)巨噬細(xì)胞功能的研究。

作者貢獻(xiàn)：徐尤年設(shè)計(jì)、收集、分析數(shù)據(jù)撰寫完成，并對(duì)文章負(fù)責(zé)；劉桂林、蒙臣輔助；張?jiān)姾Ｖ笇?dǎo)并負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制和文章審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

【關(guān)鍵詞】巨噬細(xì)胞；小鼠；細(xì)胞分離

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Highly Effective Extraction of Mouse Peritoneal Macrophages by Quick Vibrating MethodXUYou-nian,LIUGui-lin,MENGChen,etal.DepartmentofAnesthesiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430032,China

【Abstract】ObjectiveTo establish a high-efficiency method to obtain mouse peritoneal macrophages for separation and cultivation in vitro,which is quick vibrating method,by comparison with the traditional method,which is soft kneading method.MethodsIn November 2014,20 male healthy C57bl/6 rats of SPF grade were collected,and random number table method was employed to divide the rats into soft kneading group and rapid oscillation group,with 10 rats in each group.Traditional abdomen soft kneading method and quick vibrating method were employed to extract mouse peritoneal macrophages.FCM was used to detect the apoptosis rate of peritoneal macrophages,and the total number of cells and peritoneal macrophages were calculated.ResultsThe two groups were not significantly different in the body mass and the recovery rate of peritoneal lavage fluids (P>0.05).The apoptosis rate of peritoneal macrophages of soft kneading group was (5.44±0.08)%,and that of rapid oscillation group was (5.60±0.12)%,without significant differences between the two groups.The rapid oscillation group was higher than the soft kneading group in the total number of cells〔(5.69±0.23)×106vs.(3.82±0.12)×106〕 and peritoneal macrophages 〔(2.64±0.08)×106vs.(1.66±0.07)×106〕 (P<0.05).ConclusionThe extraction of peritoneal macrophages by the quick vibrating method cause no increase of the apoptosis rate of peritoneal macrophages and marked increase of the total number of cells and peritoneal macrophages.Therefore,it is a more effective method of peritoneal macrophages extraction.

【Key words】Macrophages；Mice；Cell separation

(收稿日期：2015-08-11；修回日期：2015-12-09)

【中圖分類號(hào)】R 446.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.013

通信作者：徐尤年，430032 湖北省武漢市，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科；E-mail：xyn0103@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81201454)
作者單位：430032 湖北省武漢市，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科