子宮內(nèi)膜癌組織和血清中E盒結(jié)合鋅指蛋白表達及臨床意義

陳麗娟　石　琦　陳建琴　王秀秀　劉　暢　王渠源

(吉林大學第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林　長春　130041)

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子宮內(nèi)膜癌組織和血清中E盒結(jié)合鋅指蛋白表達及臨床意義

陳麗娟石琦1陳建琴2王秀秀劉暢王渠源

(吉林大學第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春130041)

摘要〔〕目的研究E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達程度和血清蛋白濃度，探討其與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法隨機選擇116例子宮內(nèi)膜組織，其中正常內(nèi)膜組織20例，不典型增生內(nèi)膜15例，內(nèi)膜癌組織81例，應用免疫組織化學發(fā)進行標記染色，以檢測在三種組織中ZEB1蛋白的表達情況。其次應用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測20例正常內(nèi)膜、15例不典型增生、61例內(nèi)膜腺癌、12例特殊類型癌(共108例)患者血清中ZEB1蛋白表達水平。結(jié)果ZEB1蛋白在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生及正常內(nèi)膜中陽性率逐漸下降(P=0.000)。ZEB1蛋白在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生、正常內(nèi)膜血清中表達水平逐漸下降，其表達水平與組織表達水平呈正相關(guān)。結(jié)論ZEB1蛋白與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有可能成為子宮內(nèi)膜癌早期診斷及判斷預后的一個客觀依據(jù)。

關(guān)鍵詞〔〕子宮內(nèi)膜癌；E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1；浸潤；轉(zhuǎn)移

1長春市婦產(chǎn)醫(yī)院2成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

第一作者：陳麗娟(1989-)，女，碩士，主要從事婦科腫瘤研究。

子宮內(nèi)膜癌是一組上皮性惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢且出現(xiàn)年輕化。子宮內(nèi)膜腺癌約占子宮內(nèi)膜癌的60%〔1〕。子宮內(nèi)膜癌常見的癥狀為絕經(jīng)后陰道不規(guī)則出血，易早期發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜病變，但Ⅰ～Ⅱ期死亡率仍在 5%～15%〔2〕。但是現(xiàn)在對于子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制尚不十分明確。E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1是近年來發(fā)現(xiàn)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的蛋白，已在多種腫瘤中報道過，如：前列腺癌、肝癌、乳腺癌等，本研究探討ZEB1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織及血清中的表達及臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料2013年10月至2014年10月我醫(yī)院婦科行子宮切除、診斷性刮宮及宮腔鏡檢查獲得的正常子宮內(nèi)膜、不典型子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織的蠟塊116例。其中正常子宮內(nèi)膜組織20例(增生期8例，分泌期12例)，年齡32～63歲，平均49.62歲；子宮內(nèi)膜不典型增生組織蠟塊15例，年齡28～53歲，平均41.23歲，子宮內(nèi)膜癌組織81例(其中特殊類型12例：癌肉瘤、漿液性癌、透明細胞癌各2例，鱗癌6例，由于特殊類型病例較少，故不做分期及分級統(tǒng)計)；年齡35～72歲，平均52.41歲。子宮內(nèi)膜腺癌細胞分化程度是根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)在1988年提出高中低三級分化即：G1:23例，G2:27例，G3:19例，臨床分期是根據(jù)FIGO在2009年制訂的手術(shù)-病理分期標準規(guī)定進行的：Ⅰ期和Ⅱ期56例，Ⅲ期及Ⅳ期13例；子宮肌層浸潤，超過1/2為21例，未超過1/2為48例；出現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的60例。經(jīng)術(shù)后石蠟切片確定標本的病理診斷。

1.2實驗試劑一抗ZEB1抗體北京博奧森生物技術(shù)有限公司研發(fā)的，SP-9710試劑盒和DAB試劑盒是由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司研發(fā)的。ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司(96T)，其他試劑為進口或活產(chǎn)分裝試劑。

1.3免疫組化學法檢測ZEB1蛋白表達子宮內(nèi)膜組織標本常規(guī)石蠟包埋切片，先用10%甲醛固定，再連續(xù)將每個蠟塊切除三張平均4 μm厚的片子，行HE染色后，在涂有多聚賴氨酸的玻片上將切片貼附以備用下一步的免疫組化染色，采用免疫組化SP法檢測ZEB1抗體(鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶)，檢測步驟按試劑盒說明書進行。石蠟切片HE染色法：細胞核呈藍色，胞質(zhì)呈紅色，紅細胞呈橘紅色，其他成分呈深淺不同紅色。免疫組化法：陽性表發(fā)為棕黃色，細胞和用蘇木精復染為藍色。嚴格按照實驗流程操作免疫組化步驟。以淡黃色、中度黃色、棕黃色顆粒出現(xiàn)在細胞核中為陽性表達。結(jié)果判定實在200倍鏡下觀察全片的陽性細胞百分比和著色度。判定按陽性細胞百分比：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。判定按染色程度：陰性為0分，淡黃色為1分，中度黃色2分，棕黃色3分?？偡钟嫹?陽性細胞得分×染色程度，總分<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4ELISA方法檢測血清中ZEB1蛋白濃度所有入選對象均于入院后空腹抽取肘靜脈4 ml，置入不含熱源和內(nèi)毒素的試管中，操作過程中避免任何細胞刺激，3 500 r/5 min后將血清和紅細胞迅速分離，去上清液分裝入EP管中，置于-80℃冰箱保存，ELISA方法測定ZEB1蛋白濃度，試劑盒為南京建成生物有限公司，嚴格按照說明書操作。采用圖像分析系統(tǒng)測定圖片吸光度值。

1.5統(tǒng)計學方法使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗、t檢驗和Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1ZEB1表達在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)腺癌組織的情況分析ZEB1蛋白在三種組織中的陽性率逐漸下降(P=0.000)。ZEB1蛋白在腺癌組中的陽性率高于不典型增生組(P=0.003)；ZEB1蛋白在腺癌組陽性率明顯高于正常組(P=0.000)。見表1。

表1　ZEB1 在各組組織中的表達(n)

與不典型增生組比較：1)P<0.01；與正常組比較：2)P<0.001

2.2ZEB1蛋白表達與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系ZEB1蛋白的陽性表達率在手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤程度有明顯差異(P<0.05)，高分化與中分化差異不顯著(P>0.05)，中分化組與低分化組差異顯著(P<0.05)；ZEB1表達與年齡(P>0.05)及病理類型〔腺癌組43例(62.32%)vs特殊類型組7例(58.33%)，P=0.793〕無關(guān)。見表2。

表2　ZEB1陽性表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理

2.3ZEB1在血清及子宮組織中的表達的相關(guān)性ZEB1蛋白在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜腺癌的細胞核中均有表達，根據(jù)回歸曲線方程得出：正常組〔n=20,(0.07±0.03)pg/ml〕，不典型增生組〔n=15,(0.62±0.07)pg/ml〕，腺癌組〔n=61,(4.52±0.16)pg/ml〕。與腺癌組比較，正常組ZEB1濃度低(P<0.05)；不典型增生組與腺癌組比較，前者濃度低(P<0.05)。血清中ZEB1蛋白濃度與組織總吸光度呈線性相關(guān)，即表達量有差異(P<0.05)。見圖2。

圖1　ELISA檢測標準曲線

2.4血清 ZEB1 在子宮內(nèi)膜癌不同組織學分級中比較高分化(n=26)血清ZEB1表達水平(3.41±0.18 )pg/ml，中分化(n=23)(4.31±0.22)pg/ml，低分化(n=12)(5.84±0.42)pg/ml。ZEB1在子宮內(nèi)膜癌血清中隨著病理分級級別升高表達水平升高(P<0.05)。

2.5血清 ZEB1 在子宮內(nèi)膜癌病理分期中比較Ⅰ～Ⅱ期(n=52)血清 ZEB1 表達水平(4.13±0.37)pg/ml，Ⅲ～Ⅳ期(n=9)(5.49±0.46)pg/ml。ZEB1在子宮內(nèi)膜癌血清中隨著臨床分期級別升高表達水平升高(P<0.05)。

2.6血清 ZEB1 與子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=54)(3.98±0.41)pg/ml，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=7)(5.76±0.51)pg/ml。ZEB1在子宮內(nèi)膜癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達濃度高(P<0.05)。

2.7ZEB1在不同類型子宮內(nèi)膜癌血清中的表達情況子宮內(nèi)膜腺癌組(n=61)血清ZEB1表達水平(4.52±0.16)pg/ml，特殊類型組(n=12)(4.75±0.25)pg/ml。兩者無統(tǒng)計學差異。

2.8ZEB1在血清中濃度與組織總表達情況的相關(guān)性所搜集的子宮內(nèi)膜腺癌標本中有56例組織與血清是來自同一個人，是匹配進行的，分析ZEB1蛋白在組織與血清中的表達趨勢大致相同，血清中ZEB1蛋白的濃度與組織中陽性表達呈正相關(guān)〔R=0.913，R=0.000(雙側(cè))〕。

3討論

惡性腫瘤預后較差就是因為腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，ZEB1是最近較受重視的癌基因之一，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細胞作用的各個階段都有參與。近年來，在對于ZEB1中的研究中，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZEB1存在于骨肉瘤MG-63細胞中的表達水平，基因轉(zhuǎn)染未轉(zhuǎn)染組侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯高于轉(zhuǎn)染組〔3〕，下調(diào)ZEB1存在于胃癌AGS細胞中的表達水平，可以改善腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移特性〔4〕。腫瘤的形成及發(fā)展可能與ZEB1的不平衡表達有一定的關(guān)系。ZEB1蛋白在宮頸癌組織中是高表達的，且其表達率與宮頸癌的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤宮旁組織及腫瘤分化程度有一定的聯(lián)系〔5〕，研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1的表達與宮頸癌瘤體的大小無關(guān)〔6〕。ZEB1蛋白在上皮性卵巢癌中的表達明顯高于正常卵巢組織，且分化程度越高，ZEB1的表達越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無轉(zhuǎn)移者，晚期卵巢癌明顯高于早期卵巢癌，而且，ZEB1蛋白的表達與卵巢癌患者年齡及病理分類無關(guān)〔7〕，證實了ZEB1蛋白與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后有一定的關(guān)系。本實驗提示ZEB1可能促進正常細胞向惡性轉(zhuǎn)化，因而促進子宮內(nèi)膜病變。ZEB1蛋白與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。血清中的ZEB1蛋白高表達與腫瘤的低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期的患者中更有意義。通過檢測血清中的ZEB1蛋白濃度有可能成為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的腫瘤標記物之一。

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〔2014-09-23修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：王渠源(1965-)，男，碩士生導師，主任醫(yī)師，教授，主要從事婦科腫瘤研究。

中圖分類號〔〕R739〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0117-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.053