山楂葉總黃酮對慢性腦缺血大鼠腦組織c-fos、Bcl-2蛋白表達的影響

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(河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北　承德　067000)

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山楂葉總黃酮對慢性腦缺血大鼠腦組織c-fos、Bcl-2蛋白表達的影響

吳曉光檀榮方楊嵐李蒙蒙張?zhí)禅潖垙?/p>

(河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討山楂葉總黃酮(TFHL)對慢性腦缺血大鼠的治療作用及機制。方法健康雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、模型組、TFHL組、銀杏葉片組。采用永久性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備腦缺血模型。免疫組化法檢測c-fos蛋白的表達，Western印跡法檢測Bcl-2蛋白的表達，原子分光光度法檢測腦組織Ca2+含量。結(jié)果與模型組比較，TFHL顯著抑制大鼠缺血腦組織c-fos蛋白表達(P<0.01)，增加Bcl-2蛋白表達(P<0.05)，降低Ca2+含量(P<0.05)。結(jié)論TFHL對慢性腦缺血的保護作用與抑制腦神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)，其抗凋亡的機制可能與上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)c-fos表達，降低腦組織Ca2+含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕山楂葉總黃酮；慢性腦缺血；c-fos；Bcl-2；Ca2+

第一作者：吳曉光(1975-)，男，碩士，副研究員，碩士生導師，主要從事中醫(yī)藥抗癡呆機制研究。

細胞凋亡與缺血性腦損傷的關(guān)系極為密切。腦缺血后，c-fos的過度表達能阻斷細胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導而產(chǎn)生一些促調(diào)亡因子〔1〕，參與腦缺血損傷后的神經(jīng)細胞凋亡過程。Bcl-2是抑制細胞凋亡因子，與細胞凋亡密切相關(guān)，抑制或減少損傷后神經(jīng)細胞凋亡成為缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵〔2〕。山楂葉總黃酮(TFHL)是從山楂葉中提取的黃酮類化合物，具有降血脂、抗氧化等〔3〕功能，但其對c-fos和Bcl-2基因表達的影響尚不清楚。本研究采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備慢性腦缺血模型，觀察TFHL對腦缺血大鼠c-fos、Bcl-2表達的影響，并探討其可能機制，為防治缺血性腦血管病提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥物與試劑摘采承德本地7～8月份的山楂樹葉，采用水煎醇沉法〔4〕提取TFHL，純度為65.2%。c-fos、Bcl-2多克隆抗體(武漢博士德生物科技有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中山金橋生物科技有限公司)。

1.2動物模型制備及分組清潔級SD大鼠72只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供〔格證號：scxk(京)2012-0001〕。隨機分等為四組：假手術(shù)組、模型組、TFHL組、銀杏葉片組。采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立大鼠腦缺血模型〔5〕，假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎。術(shù)后第7天開始，TFHL組及銀杏葉片組大鼠分別灌胃給予TFHL 140 mg·kg-1·d-1和銀杏葉片12.3 mg·kg-1·d-1，共21 d。假手術(shù)組及模型組給予等量的生理鹽水。

1.3觀察指標及方法

1.3.1免疫組化檢測c-fos蛋白的表達末次給藥后1 h，4%水合氯醛麻醉，10% 甲醛心臟灌注固定，取視交叉后2～8 mm之間的腦組織，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚冠狀面切片。切片經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，0.3%H2O2孵育30 min，山羊血清封閉30 min，滴加c-fos一抗(1∶100)40 μl，4℃冰箱過夜，生物素標記羊抗兔IgG 50 μl孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察，拍片。MINT圖像分析系統(tǒng)分析陽性表達產(chǎn)物的光密度值。

1.3.2Western印跡法檢測Bcl-2蛋白的表達末次給藥后1 h，0.01 mol/L PBS洗凈血液，加入裂解液和10 μl PMSF(10 mg/ml)，4℃勻漿，10 000 r/min，離心30 min ，取上清液，BAC蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。再經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶粉封閉，加Bcl-2一抗(1∶150)4℃過夜，HRP標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2.5 h，Super ECL Plus 超敏發(fā)光液發(fā)光，X線片暗盒內(nèi)曝光，D72顯影液顯影，利用Quantity One軟件分析X線膠片的灰度值。

1.3.3原子分光光度法檢測Ca2+含量末次給藥后1 h，大鼠斷頭，取腦組織，剝離軟腦膜，超純水漂洗，去除殘余血液，60℃溫箱烘烤48 h，分析天平稱重，滴加濃硝酸，逐漸全部消化成溶液，取樣，1%CaCl2稀釋，利用原子分光光度法檢測樣品Ca2+含量。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織c-fos蛋白的表達與假手術(shù)組比較，模型組c-fos蛋白升高(324.78.94±50.37)%〔(0.046 3±0.005 83)，P<0.01〕；與模型組比較，銀杏葉片組(0.016 8±0.000 54)和TFHL組(0.017 6±0.000 61)的c-fos蛋白分別降低了(63.71±11.42)%和(61.98±11.27)%，具有顯著差異(P<0.01)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無差異(P>0.05)。見表1，圖1。

圖1　各組大鼠腦組織c-fos蛋白的表達(DAB，×400)

2.2各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白的表達假手術(shù)組(0.28±0.02)有少量的Bcl-2蛋白表達。與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2蛋白的表達升高(17.89±3.19)% (0.33±0.06，P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉片組(0.70±0.08)和TFHL組(0.68±0.09)的Bcl-2蛋白的表達明顯增高(112.12±6.14)%和(106.01±5.81)%，具有顯著差異(P<0.01)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無差異(P>0.05)。見圖2。

圖2　各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達

2.3各組大鼠腦組織Ca2+的含量模型組大鼠腦組織Ca2+含量較假手術(shù)組顯著增加(117.20±5.18)%〔(231.51±11.47)vs(106.59±6.87)μg/g，P<0.01〕；與模型組比較，銀杏葉片組〔(142.32±5.17)μg/g〕和TFHL組〔(145.91±5.78)μg/g〕腦組織Ca2+含量分別降低了(38.53±2.13)%和(36.97±2.01)%，具有顯著性差異(P<0.05)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無差異(P>0.05)。

3討論

腦血管疾病是由各種病因引起腦血管損傷所導致的一組臨床疾病，其中缺血性腦血管疾病是最常見類型，其發(fā)病率、病

殘率和病死率高，并常常伴有學習及認知功能障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。腦血管疾病常常引起大腦神經(jīng)功能缺失，而神經(jīng)細胞凋亡是造成腦神經(jīng)功能缺失的重要因素，抑制或減少損傷后神經(jīng)細胞凋亡則是為缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵〔2〕。c-fos基因是mys家族的一員，編碼核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。正常生理情況下，c-fos基因存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，處于低表達或靜止狀態(tài)，不易檢測〔1〕。但在腦缺血損傷后，c-fos基因作為即刻早期反應(yīng)基因迅速作出反應(yīng)進行表達，其表達產(chǎn)物fos蛋白在生長因子刺激下，促進細胞分裂增殖，但c-fos過度表達時則會誘發(fā)細胞凋亡〔6，7〕；缺血還可促使Ca2+大量內(nèi)流，神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載，引發(fā)神經(jīng)細胞的損傷或死亡，導致腦神經(jīng)功能障礙。本研究結(jié)果顯示，腦缺血可以誘導神經(jīng)細胞凋亡，表明TFHL可通過抑制c-fos蛋白過度表達，降低Ca2+超載，減輕神經(jīng)細胞損傷。

Bcl-2是公認的具有抑制細胞凋亡作用的蛋白，可以抑制Bax從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜，保護線粒體電勢梯度，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)從而抑制內(nèi)在凋亡途徑〔8〕。因此，Bcl-2蛋白表達量直接決定神經(jīng)細胞的存活與凋亡取向。本研究結(jié)果顯示，腦組織缺血缺氧，Bcl-2蛋白表達受到抑制，而c-fos過度表達，Ca2+超載，從而加快了神經(jīng)細胞凋亡。應(yīng)用山楂葉總黃酮可明顯增加缺血腦組織Bcl-2蛋白的表達，從而抑制或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細胞凋亡。因此，TFHL的作用機制可能與其抑制Ca2+超載，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，減少促凋亡蛋白c-fos表達有關(guān)，但其減輕腦缺血誘導神經(jīng)細胞凋亡的具體機制，還需要進一步研究。

參考文獻4

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8郭佳,肖傳實,白瑞,等.脂聯(lián)素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響〔J〕.中國藥理學通報,2012;28(7):930-3.

〔2014-08-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：河北省科技廳指令課題(152777890)；河北省教育廳青年基金指令課題(QN201403)；河北省高校省級重點學科資助項目(2013年)；河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室建設(shè)項目資助(2013年)

中圖分類號〔〕R749〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0033-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.014