雷公藤配伍金錢草抗肺癌增效作用的組成配比及其量效關系

王君明　孫玉宇　張月月　陳玉龍　李曉冰　苗明三　崔　瑛　屈凌波

(河南中醫(yī)學院呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南　鄭州　450046)

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雷公藤配伍金錢草抗肺癌增效作用的組成配比及其量效關系

王君明孫玉宇1張月月陳玉龍李曉冰苗明三崔瑛屈凌波2,3

(河南中醫(yī)學院呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450046)

摘要〔〕目的考察雷公藤(LGT)配伍金錢草(JQC)體外抗人非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞增效作用的組成配比及其量效關系。方法將LGT與JQC按照不同質量配比(1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)混合后，分別用水和75%乙醇回流提取，制備LGT/JQC飲片不同質量配比的提取物；采用體外MTT法檢測LGT-JQC不同配比配伍提取物(200 μg/ml)對人A549細胞增殖抑制的影響，確定LGT-JQC配伍增效作用的最佳組成配比；進一步采用體外MTT法檢測最佳組成配比的提取物對人A549細胞增殖抑制作用的量效關系，計算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。結果LGT-JQC在質量配比2/1～4/1配伍的醇提物(200 μg/ml)具有抑制NSCLC A549細胞增殖的增效作用(P<0.05)，且配比在2/1時增效作用最強(與配比4/1組比較，P<0.01)，而LGT-JQC配伍的水提物(200 μg/ml)在既定配比下均無增效作用(P>0.05)；LGT-JQC配比在2/1(最佳配比)的醇提物，在濃度為50～400 μg/ml范圍內對A549細胞的增殖抑制呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性關系，其IC50值為249.40 μg/ml。結論LGT-JQC配伍的醇提物對體外人小細胞肺癌A549細胞增殖的抑制具有協(xié)同增效作用，二者組成配比應在2/1～4/1，尤以在2/1作用為佳；LGT-JQC配比為2/1的醇提物，在濃度為50～400 μg/mL對A549細胞的增殖抑制具有良好的量效關系。

關鍵詞〔〕雷公藤；金錢草；非小細胞肺癌；組成配比；配伍增效；量效關系

1洛陽理工學院環(huán)境工程與化學系2鄭州大學化學與分子工程學院

3河南工業(yè)大學化學化工學院

第一作者：王君明(1980-)，男，博士，副教授，主要從事中藥藥性藥效機制及新藥開發(fā)研究。

雷公藤(LGT)為衛(wèi)矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的干燥根，性寒，味苦、辛，歸肝、腎經，功效祛風除濕、活血通絡、消腫止痛和殺蟲解毒，具有廣譜抗癌活性，但毒性較大〔1〕，限制了其療效發(fā)揮及應用。中醫(yī)藥理論、配伍應用及現(xiàn)代配伍研究結果均表明，LGT配伍金錢草(JQC)具有減毒增效作用〔2～4〕。本研究旨在考察LGT-JQC配伍對人非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞抗癌增效作用的組成配比及其量效關系。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞株A549細胞株由河南中醫(yī)學院分子生物學實驗中心提供。

1.1.2試藥5-氟尿嘧啶(5-Fu)：購于上海伊卡生物技術有限公司，純度≥99%(HPLC)，批號：EK140319。LGT：產地廣西，批號121101，經河南中醫(yī)學院藥學院生藥學科陳隨清教授鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤的干燥根。JQC：產地廣東，批號130912，經河南中醫(yī)學院藥學院生藥學科陳隨清教授鑒定為報春花科植物過路黃(Lysimachia christinae Hance)的干燥全草。RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清：HyClone公司；MTT：Amresco公司；DMSO：Amresco公司；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)含酚紅：Solarbio公司。

1.1.3主要儀器酶標儀(BioTek ELx800uv)；Heraeus細胞培養(yǎng)箱(德國Kendro)；倒置顯微鏡(ZESS)；SG-603生物安全柜(Bake)；Milli-Q Advantage A10型超純水機(Millipore)；3-18K高速冷凍離心機(Sigma)；TDL-40B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；XK96-B渦流混合器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；BS210S型電子天平(北京塞多利斯天平有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；HH6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1提取物的制備

1.2.1.1水提物分別取適量飲片的LGT、JQC、LGT-JQC不同質量配比組合物(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)，加10倍量水(W/V=1∶10)，浸泡1 h后，回流提取3次，每次2 h，以4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收水，減壓干燥得干浸膏，稱重，見表1。

1.2.1.2醇提物分別取適量飲片的LGT、JQC、LGT-JQC不同質量配比組合物(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)，加10倍量75%乙醇(W/V = 1∶10)，浸泡1 h后，回流提取3次，每次2 h，以4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收乙醇，減壓干燥得干浸膏，稱重，得率見表1。

表1　LGT與JQC單提及不同配比合提的水醇提物得率(%)

1.2.2MTT法測定細胞增殖抑制率

1.2.2.1細胞培養(yǎng)細胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，每隔48 h更換1次培養(yǎng)基，實驗時細胞用消化液(0.02% EDTA)和0.25%胰蛋白酶(以1∶1比例配制)進行消化，接種于96孔板。

1.2.2.2MTT法測定細胞增殖抑制率細胞以1×104/孔接種96孔培養(yǎng)板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。設對照組(醇提物以0.4%DMSO為對照，水提物以雙蒸水為對照)、藥物組(水提物用雙蒸水溶解；醇提物用DMSO溶解，并使作用于細胞的DMSO終濃度不高于0.4%)，每組3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)上清，每孔加入0.5 mg/ml的MTT 100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去上清，并加入150 μl DMSO溶解紫色沉淀，用酶標儀在波長為570 nm/630 nm，測定光密度D(λ)值。實驗重復3次。按下式計算抑制率(Inhibition ratio)(%)= 〔1-D(λ)實驗孔/D(λ)對照孔〕× 100%。計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS11.5軟件，多組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD法。

2結果

2.1LGT與JQC水提物體外抑制與對照組(0.49%)比較，LGT、JQC、LGT-JQC的不同質量配比(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)組成的水提物(200 μg/ml)均能顯著抑制A549細胞增殖，抑制率分別為8.97%、13.37%、12.76%、12.22%、14.42%、13.04%、12.10%(P<0.05)；與單用藥(選擇增殖抑制率較高的JQC組作為比較對象)組比較，LGT/JQC各配比對人A549細胞增殖的抑制作用無顯著性差異(P>0.05)。

2.2LGT與JQC醇提物體外抑制與對照組(2.46%)比較，LGT、JQC、LGT-JQC的不同質量配比(LGT/JQC=1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)組成的醇提物(200 μg/ml)均能顯著抑制A549細胞增殖，抑制率分別為27.13%、10.18%、12.02%、17.70%、25.04%、39.70%、33.13%(P<0.05)；與單用藥(選擇增殖抑制率較高的LGT組作為比較對象)組比較，LGT/JQC在質量配比為1/1時對人A549細胞增殖的抑制作用無顯著性差異(P>0.05)。在質量配比為2/1～4/1時對人A549細胞增殖的抑制作用較單用LGT組顯著提高(P<0.05)；與配比4/1組比較，LGT/JQC在質量配比為2/1時對人NSCLC A549細胞增殖抑制作用更強(P<0.01)。

2.3JQC與LGT最佳配比的醇提物體外抑制與對照組(2.91%)比較，LGT/JQC在最佳質量配比(LGT/JQC=2/1)組成的醇提物(50,100,200,300,400 μg/ml)及陽性對照藥5-Fu(6.5 μg/ml)均能顯著抑制人NSCLC A549細胞增殖，抑制率分別為16.38%，24.80%、42.19%、57.29%、62.60%、42.09%(P<0.05)，且LGT/JQC配伍醇提物隨著濃度的增加對A549增殖抑制作用增強，其IC50值為249.40 μg/ml。進一步分析顯示，LGT/JQC配伍醇提物在濃度為200 μg/ml時對人A549細胞增殖的抑制與陽性藥5-Fu的作用相當(P>0.05)，在300 μg/ml和400 μg/ml均比5-Fu對A549細胞的增殖抑制作用強(P<0.01)。

3討論

NSCLC惡性程度高，生物學特性復雜，且預后差，目前治療以手術、化療、放療為主，但5年生存率不到15%〔5〕。西醫(yī)治療在縮小瘤體方面有一定的優(yōu)勢，而中醫(yī)治療除具有直接抗腫瘤的作用外，還可以配合放療和化療，起到增效減毒的作用，增強患者對放療和化療的耐受性，提高生存質量，對某些晚期肺癌無法手術者，可服抗癌中藥延長生存期〔6,7〕。因此，從中醫(yī)藥中尋找新的腫瘤防治藥物及方式(如聯(lián)合用藥)是近年來研究的熱點。

LGT與JQC合用屬于中藥相殺配伍的范疇〔2〕，其中來自LGT的二萜、三萜類成分和JQC所含的黃酮類、多糖類成分均具有抗腫瘤作用〔8～11〕。然而迄今為止，有關LGT/JQC配伍在抗腫瘤活性上的增效作用尚未見任何研究報道，限制了LGT與JQC配伍的科學合理應用。本研究結果顯示，LGT-JQC配伍的醇提物對體外人NSCLC A549細胞增殖的抑制具有協(xié)同增效作用，二者組成配比應在2/1～4/1，尤以在2/1作用為佳。提示通過聯(lián)合JQC用藥一方面可以對LGT起到抗肺癌增效作用，另一方面還可起到降低LGT用量從而降低其中毒的風險。此外，LGT-JQC配比為2/1的醇提物，在濃度為50～400 μg/ml對A549細胞的增殖抑制具有良好的量效關系，LGT/JQC配伍醇提物在濃度為200 μg/ml時對人A549細胞增殖的抑制與陽性藥5-Fu的作用相當，在300 μg/ml和400 μg/ml均比5-Fu對A549細胞的增殖抑制作用強。本研究將為LGT與JQC聯(lián)合抗癌尤其在防治NSCLC方面提供實驗依據。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯李相軍)

Component ratio and dose-effect relationship of Tripterygium wilfordii combined with Lysimachia christina in inhibiting A549 non-small cell lung cancer cells in vitro

WANG Jun-Ming,SUN Yu-Yu,ZHANG Yue-Yue,etal.

Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the component ratio and dose-effect relationship of Tripterygium wilfordii (LGT) combined with Lysimachia Christina (JQC) in inhibiting A549 non-small-cell lung carcinoma (NSCLC) in vitro,for the first time.MethodsReflux extraction was used to prepare water or 75% ethanol extracts in different mass component ratios (1/4,1/2,1/1,2/1,4/1) of LGT and JQC.MTT assay was used to test the inhibition of cell proliferation and thus to determine the component ratio and dose-effect relationship of LGT combined with JQC in inhibiting NSCLC A549 cells in vitro.Besides,SPSS statistical software was used to calculate the 50% inhibitory concentration (IC50).ResultsEthanol extracts (200 μg/ml) of LGT-JQC in ratio of 2/1 to 4/1 had synergistic effect in inhibiting NSCLC A549 cell proliferation (P<0.05),and the effect of LGT-JQC in the 2/1 ratio was stronger than that of the 4/1 one (P<0.01),while the water extracts (200 μg/ml) of LGT-JQC in each given component ration had no synergistic effect (P>0.05).The ethanol extract of LGT-JQC in the 2/1 ratio at a concentration of 50～400 μg/ml range all inhibited the proliferation of A549 cells and showed a good dose-dependent manner,and its IC50 value was 249.40 μg/ml.ConclusionsThe ethanol extract of LGT-JQC compatibility has synergistic effect on NSCLC A549 cell proliferation in vitro,the mass component ratio should be at 2/1 to 4/1,and in particular the role better in 2/1.The ethanol extract of LGT-JQC in 2/1 ratio at a concentration of 50～400 μg/ml inhibits the proliferation of A549 cells with good dose-effect relationship.

【Key words】Tripterygium wilfordii Hook.f.;Lysimachia christinae Hance;Non-small-cell lung carcinoma;Component ratio;Compatibility synergy effect;Dose-effect relationship

通訊作者：屈凌波(1963-)，男，博士，博士生導師，教授，主要從事藥物化學分析及中藥活性成分作用機制研究。

基金項目：國家自然科學 (81473368)；國家自然科學基金青年科學 (81503269)；中國博士后科學基金(2012M521412)；河南中醫(yī)學院省屬科研業(yè)務專項(2014KYYWF-QN01)；河南中醫(yī)學院科技創(chuàng)新團隊(2011XCXTD01)

中圖分類號〔〕R73〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0014-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.006