狼毒大戟石油醚提取物對小鼠肝臟細(xì)胞凋亡及p-ERK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3的影響

蔡珍珍　金　銘　楊盼盼　劉吉成

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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狼毒大戟石油醚提取物對小鼠肝臟細(xì)胞凋亡及p-ERK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3的影響

蔡珍珍金銘1楊盼盼劉吉成1

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討狼毒大戟石油醚提取物對小鼠肝臟細(xì)胞凋亡及磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達(dá)的影響。方法80只昆明種小白鼠隨機分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和植物油對照組，每組20只。采用腹腔注射法給藥，1次/d(0.39、0.78、1.55 mg·kg-1·d-1)。于實驗第14天分別進(jìn)行體重測量，對小鼠肝臟組織進(jìn)行HE染色，TUNEL法原位標(biāo)記凋亡細(xì)胞，采用免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，Western印跡法檢測p-ERK、Caspase-3蛋白表達(dá)。實時定量PCR對Bcl-2、Bax、Caspase-3進(jìn)行定量分析。結(jié)果與植物油對照組比較，高劑量組小鼠體重明顯下降，肝臟細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，p-ERK、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Caspase-3產(chǎn)生活化形式的Cleaved-Caspase-3。結(jié)論狼毒大戟石油醚提取物可使小鼠肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機制可能與降低p-ERK、Bcl-2，增強Bax蛋白表達(dá)，并使Caspase-3產(chǎn)生活化形式的Cleaved-Caspase-3有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕狼毒大戟；凋亡；Bcl-2

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院多基因病研究所

第一作者：蔡珍珍(1982-)，女，碩士，助理研究員，主要從事抗腫瘤、抗抑郁藥物研究。

狼毒大戟是大戟科植物，文獻(xiàn)報道稱，狼毒大戟可用于治療肝癌、肺癌、胃癌等惡性腫瘤，對結(jié)核桿菌也有較好的抑制作用〔1〕，臨床療效顯著，并未發(fā)現(xiàn)對心、肝、腎等系統(tǒng)的不良反應(yīng)。本實驗使用狼毒大戟石油醚提取物，對昆明種小鼠進(jìn)行體內(nèi)試驗，發(fā)現(xiàn)其對小鼠肝臟具有一定的毒性。

1材料與方法

1.1動物、藥品、試劑及儀器近郊系昆明種小白鼠，雄性，清潔級，體重(20±2)g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。狼毒大戟石油醚提取物，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥物研究所提供，使用植物油將藥物配制成所需濃度，過濾備用。免疫組化染色：一抗(康為生物有限公司，兔抗小鼠Bax單克隆抗體，兔抗小鼠Bcl-2單克隆抗體)免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑、PBS緩沖液(購于康為生物有限公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR? ExScriptTM RT-PCR Kit(Pefect Real Time)、PCR試劑盒RNAiso Reagent(購于寶生物工程有限公司)。Western印跡：一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔單克隆抗體ERK、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3。PCR System 擴增儀2700(Applied Biosystems公司)，熒光定量PCR儀ABI 7300(ABI 公司)。光學(xué)顯微鏡CX31R BSF(Olympus)，圖像分析系統(tǒng) DP801(Alphamiager公司)，DK-8D型電熱恒溫水浴箱(上海合恒儀器設(shè)備有限公司)，METTLER TOLEDO PH測試儀(上海秋騰貿(mào)易有限公司)，79-1磁力加熱攪拌器(上海雷磁新涇儀器有限公司)，THZ-82型恒溫振蕩器(江蘇太倉醫(yī)療器械廠)，AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，HL-2000電子雜交箱〔香港興萬電子儀器(廈門)有限公司〕，SF-300型手壓式封口機(海旗榮實業(yè)有限公司)，24DN制膠器(北京市六一儀器廠)，TS-100脫色搖床(南京庚辰科學(xué)儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組近郊系昆明種小白鼠80只，實驗開始前進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，保持環(huán)境安靜，溫度保持在18～20℃，自然光線，實驗小鼠未發(fā)現(xiàn)有孕，狀態(tài)良好。隨機分為四組：植物油對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組20只。

1.2.2給藥參照文獻(xiàn)〔2〕LD50測定值，給予腹腔注射，低、中、高劑量組給藥量分別為0.39、0.78、1.55 mg·kg-1·d-1，植物油對照組給予等體積植物油。連續(xù)注射14 d，不禁食水，末次給藥后禁食16～20 h，斷頸處死小鼠，取肝臟組織置于冰生理鹽水中充分洗滌，濾紙吸干，稱取肝組織備用。

1.2.3TUNEL法檢測小鼠肝臟組織凋亡石蠟包埋的肝臟組織，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法檢測。根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞分布情況，每張切片取10個陽性視野，每個視野以30個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)來計數(shù)，平均陽性細(xì)胞所占百分比，即細(xì)胞凋亡率(AR)。

1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2、Bax取石蠟包埋的肝臟組織，相應(yīng)部位連續(xù)切片各5張，采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并DAB顯色，通過蘇木素復(fù)染、水洗、鹽酸乙醇分化后返藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。每一張切片在陽性表達(dá)區(qū)域挑選10個無重疊視野，使用Olympus顯微鏡、DP801形態(tài)分析軟件進(jìn)行圖像采集處理，圖像分析儀進(jìn)行分析，測出Bcl-2、Bax蛋白抗原表達(dá)的總面積、陽性細(xì)胞數(shù)和平均吸光度A，計算其積分吸光度(IA)。

1.2.5Western印跡法檢測磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)按每泳道加入總蛋白4 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，4℃封閉過夜，加入一抗p-ERK、Bcl-2、Bax、Caspase-3，溫箱孵育2 h，漂洗后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶5 000，經(jīng)過ECL化學(xué)發(fā)光劑曝光顯影，每組實驗重復(fù)三次，結(jié)果使用Gel-Pro4軟件進(jìn)行半定量分析，計算相對光密度值。

1.2.6檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表達(dá)取凍存肝臟組織4℃解凍以后，放入DEPC處理的EP管中，在低溫冰塊上將其剪碎，加入1 ml Trizol液體進(jìn)行組織勻漿。提取總RNA：按照RNAiso Reagent 試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，通過紫外分光光度計以及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度、濃度及其完整性。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照SYBR? ExScriptTM實時定量PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法進(jìn)行實驗：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃,15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95℃，2 min。PCR反應(yīng)：采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit試劑盒相應(yīng)反應(yīng)體系，總體積為25 μl。引物的序列如下：Bcl-2正義鏈：5′-AAGCACATCCAATAAAAGCGC-3′，Bcl-2，反義鏈：5′-GTTATCATACCCTGTTCTCCCG-3′，Bax正義鏈：5′-GAGACACCTGAGCTGACCTTG-3′,Bax反義鏈：5′-GAAGTTGCCATCAGCAAACAT-3′，Caspase-3，反義鏈：5′-AAGGAGCAGCTTTGTGTGTGT-3′,Caspase-3，反義鏈：5′-AAGAGTTTCGGCTTTCCAGTC-3′；GAPDH正義鏈：5′-GACAATTTTGGCATCGTG-3′,GAPDH反義鏈：5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。分別擴增Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH，每個樣本做3個復(fù)孔，得到閾循環(huán)值(Ct)平均值，計算ΔΔCt值，各個樣本mRNA表達(dá)水平均以2-ΔΔCT表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS13.0軟件包行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2結(jié)果

2.1肝臟細(xì)胞凋亡計數(shù)見圖1。經(jīng)過TUNEL染色以及蘇木精復(fù)染以后，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，正常細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)染。植物油對照組僅可見極少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞，高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。

圖1　小鼠肝臟細(xì)胞TUNEL檢測(×100)

圖2　小鼠肝臟組織中Bcl-2蛋白表達(dá)(DAB，×100)

圖3　小鼠肝臟組織中Bax蛋白表達(dá)(DAB，×100)

2.2肝臟組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 如圖2，圖3所示，Bcl-2、Bax主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析測得的(IA)值Bcl-2表達(dá)隨給藥劑量增加而降低，Bax與Bcl-2的表達(dá)呈相反狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但低、中劑量組間無差異(P>0.05)。

2.3各組小鼠肝臟組織中p-ERK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)小鼠肝臟組織中的p-ERK蛋白隨劑量增加表達(dá)降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白低劑量組變化不明顯，中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白低劑量組變化不明顯，中、高劑量組表達(dá)明顯增高(P<0.05)，該提取物可以使Caspase-3活化，產(chǎn)生活性形式的Cleaved Caspase-3，低劑量時不促進(jìn)Caspase-3及活化的Caspase-3蛋白表達(dá)，中、高劑量組Caspase-3及活化的Cleaved Caspase-3蛋白均增高(P<0.05)。見圖4。

2.4小鼠肝臟組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA含量與植物油對照組相比，高劑量組中Bcl-2明顯下調(diào)，而Bax明顯上調(diào)(P<0.05)，并呈劑量依賴關(guān)系，隨劑量增高Bax/Bcl-2比值增大。Caspase-3隨劑量增加而呈上調(diào)趨勢。見表1～表3。

1～4：植物油對照組、低、 中、高劑量組圖4　小鼠肝臟組織中凋亡相關(guān)蛋白檢測

組別CTBcl-2CTGAPDHΔCTBcl-2ΔCTGAPDHΔΔCTBcl-2相對表達(dá)量植物油對照組17.21±0.3115.12±0.12-17.29±0.16-17.78±0.120.49±0.050.71低劑量組17.35±0.2315.09±0.05-17.35±0.21-17.81±0.130.66±0.100.63中劑量組18.11±0.2115.04±0.09-16.39±0.19-17.86±0.091.47±0.100.362)高劑量組18.96±0.3315.11±0.11-15.54±0.2417.79±0.112.25±0.120.211)2)

與植物油對照組比較：1)P<0.05；與前一劑量組比較：2)P<0.05，下表同

表2　小鼠肝臟細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)

表3　小鼠肝臟細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)

3討論

狼毒大戟是一種有毒中藥，近年來許多學(xué)者都在其抗腫瘤、抗炎等方面進(jìn)行了大量的研究，并且取得了實質(zhì)性的進(jìn)展。其原植物的水、醇、石油醚等的提取物均有抑制腫瘤發(fā)展的作用，報道稱其為高效低毒的藥品，但本實驗發(fā)現(xiàn)，其石油醚提取物對小鼠肝臟具有一定的毒性，解剖可見，肝臟大小無明顯變化，質(zhì)地柔軟，無粘連，色澤光亮。顯微鏡下觀察肝臟組織變化不明顯。隨著給藥時間和劑量的增加，部分肝小葉內(nèi)可見細(xì)胞核消失，細(xì)胞質(zhì)成深紅濃染的嗜酸性小體。個別高劑量小組的小鼠狀態(tài)仍然良好。TUNEL法檢測的小鼠肝臟細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高劑量組中肝臟細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡。

細(xì)胞的凋亡發(fā)生、發(fā)展，受到細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控與影響，細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白分為促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白兩類，細(xì)胞是否發(fā)生凋亡取決于兩種蛋白相互拮抗失衡的狀態(tài)。目前已知的凋亡調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2家族在各類刺激信號引發(fā)的凋亡中起到關(guān)鍵的作用〔3,4〕。在細(xì)胞線粒體上的Bcl-2與Bax蛋白水平的高低直接關(guān)系到細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，Bcl-2抑制凋亡。于是有人提出細(xì)胞在受到刺激后所表現(xiàn)的的生存能力由Bcl-2與Bax兩者的比率決定〔5,6〕,Bcl-2表達(dá)水平較高時，比率上調(diào)，可形成Bcl-2/Bax的異二聚體，抑制細(xì)胞凋亡；Bax表達(dá)水平較高時，比率下調(diào)，形成Bax/Bax同二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔6〕。近年來，許多機構(gòu)的研究表明細(xì)胞凋亡的內(nèi)在變化有一定的規(guī)律〔7～10〕。

目前在人類已鑒定了4條MAPK途徑：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑，C-Jun基末端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白(SAPK)途徑，ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶1(BMK1)途徑和p38 MAPK(p38 MAPK)傳導(dǎo)途徑〔11〕。其中ERK通路主要被分裂原激活,如生長因子與受體結(jié)合后,能激活小G蛋白Ras,進(jìn)而激活Raf→MEK→ERK通路。Ketam等〔12,13〕認(rèn)為，抑制P38通路的同時可以加強ERK的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生延遲。該實驗中，p-ERK蛋白的表達(dá)隨劑量的增加而降低，有可能參與了凋亡反應(yīng)的調(diào)控。

Caspase是哺乳動物細(xì)胞發(fā)生凋亡的啟動、執(zhí)行者〔14〕，其中Caspase-3是該酶家族級聯(lián)下游最關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)蛋白酶，Bcl-2通過干擾細(xì)胞色素C的釋放進(jìn)而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔15〕。Bax作為線粒體膜上離子離子通道的組成部分，使得細(xì)胞色素C得以順利穿過線粒體膜而激活Caspase-9蛋白，進(jìn)一步激活Caspase-3，最終引起細(xì)胞凋亡。

本實驗結(jié)果證明，狼毒大戟石油醚提取物對小鼠的肝臟細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，隨著給藥劑量的增加，小鼠肝臟組織發(fā)生病理改變，從分子層面上講，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)逐漸的增加，說明狼毒大戟石油醚提取物直接或者間接通過別的信號途徑激活了Caspase-3、Bax，并使Bax/Bcl-2比率下調(diào)，細(xì)胞凋亡明顯增多，這一結(jié)果與TUNEL的檢驗結(jié)果相一致。其毒性作用機制可能是通過ERK通路調(diào)節(jié)線粒體上的Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，最終活化Caspase-3，啟動凋亡程序。

狼毒大戟是一種近年來研究較多的抗炎、抗腫瘤藥物，通過該實驗證實了，其存在一定的毒性，但是就其當(dāng)下對抗腫瘤的效果來說，期待能夠通過藥物配伍達(dá)到提高抗炎、抗腫瘤，并成功減毒的效果。使其在發(fā)揮新的藥物功能的同時更好地服務(wù)于醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)。

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〔2014-09-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

·基礎(chǔ)研究·

Effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cell apoptosis and the expression of p-ERK，Bcl-2，Bax and Caspase-3 in mice

CAI Zhen-Zhen, JIN Ming, YANG Pan-Pan,etal.

Institute Mental Health，Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cells apoptosis in mice and the expressions of phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (p-ERK)，Bcl-2，Bax,Caspase-3 in the liver of mice.MethodsEighty Kunming mice were randomly divided into low dose, middle dose, high dose and the control groups with vegetable oil(0.39, 0.78, 1.55 mg·kg-1·d-1)，20 in each group. Model was made by intraperitoneal injection 1 time/day. In the experiment of 14 days，weight was measured, HE dyeing was used to detect liver pathologic morphology, TUNEL was used to detect liver cell apoptosis. Bcl-2 and Bax protein expression were tested by immunohistochemical staining method. The protein expressions of p-ERK and Caspase-3 were detected by western blot. Real-time PCR was used for quantitative analysis of Bcl-2, Bax and Caspase-3.ResultsCompared with the control group, the weights were decreased significantly, liver cell apoptosis was more obvious, the protein expressions of p-ERK and Bcl-2 were decreased while Bax were increased, the protein expressions of Caspase-3 was activated to Cleaved-Caspase-3 in high dose group(P<0.05).ConclusionsPetroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana could result in apoptosis of liver cells in mice. The mechanism may be related to reduce p-ERK and Bcl-2, enhance Bax protein expression, and produce activated Caspase-3 forms of Cleaved-Caspase-3.

【Key words】Euphorbia fischeriana；Apoptosis；Bcl-2

通訊作者：劉吉成(1958-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事抗腫瘤藥物研究。

基金項目：國家自然科學(xué) (81573660)

中圖分類號〔〕R285〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0001-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.001