膀胱癌體內(nèi)模型研究進(jìn)展

朱越華 鄭昱 聶迪森 秦衛(wèi)軍

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·綜述·

膀胱癌體內(nèi)模型研究進(jìn)展

朱越華 鄭昱 聶迪森 秦衛(wèi)軍

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在2012年，世界范圍內(nèi)約有430 000例新發(fā)病例和165 000例死亡病例[1]。一般情況下，約有70%的非肌層浸潤性腫瘤實(shí)施局部切除術(shù)后再輔助膀胱內(nèi)的免疫治療或化療會有較高的治愈率[2]，但其中約10%～20%的腫瘤會復(fù)發(fā)并進(jìn)展為肌層浸潤性腫瘤[3-4]，而肌層浸潤性膀胱腫瘤患者預(yù)后不良，5年生存率較低[5]。由于膀胱癌的高復(fù)發(fā)率，使得患者不得不接受根治性膀胱切除術(shù)，必要時(shí)需聯(lián)合化療和放療，降低了生活質(zhì)量。對于這些膀胱腫瘤患者，療效的不理想和結(jié)果的不可預(yù)測性導(dǎo)致臨床醫(yī)生需要尋找可靠的模型來研究和探索新的策略，以提高治療效果。本文就目前主要的膀胱癌體內(nèi)模型進(jìn)行小結(jié)。

一、化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)模型

化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)模型是利用化學(xué)致癌物直接作用于膀胱上皮，模擬膀胱癌產(chǎn)生的病理機(jī)制，屬于膀胱癌的經(jīng)典體內(nèi)模型。1964年首次出現(xiàn)這種方法的報(bào)道，是第一種用于評估膀胱癌化療效果的臨床前模型[6-7]。在此之后使用過多種致癌物質(zhì)作用于不同的物種，包括小鼠、大鼠和狗等，但大多數(shù)化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)模型使用的是N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝胺(BBN)，BBN被認(rèn)為與人類膀胱癌的產(chǎn)生密切相關(guān)，動物通過飲用含有BBN的水而產(chǎn)生膀胱腫瘤，雖然該方法通過全身給藥而不是直接作用于膀胱，但膀胱上皮與其他組織相比更容易受到BBN的影響[8-10]。另外，也有通過利用N-甲基亞硝基脲(MNU)進(jìn)行膀胱灌注，每兩周予膀胱灌注MNU溶液0.1 ml(0.2 mg)，共4次，該方法有效建立了膀胱癌模型[11]。

這種模型的優(yōu)點(diǎn)在于真實(shí)模擬了膀胱癌產(chǎn)生的病理過程，相對簡單的實(shí)現(xiàn)了膀胱內(nèi)腫瘤的產(chǎn)生。但這種方法的缺點(diǎn)是毒性作用較大，動物死亡可能性高，同時(shí)動物對致癌劑的反應(yīng)不一，不同品系、品種的動物敏感性不同，很難實(shí)現(xiàn)特定病理類型的建模。

二、轉(zhuǎn)基因小鼠(genetically-engineered mouse, GEM)模型

尿路上皮被認(rèn)為是體內(nèi)更新最慢的上皮之一，體現(xiàn)了其生物轉(zhuǎn)變的特殊背景，致癌基因的激活或抑制的失活被認(rèn)為是膀胱腫瘤發(fā)生的至關(guān)重要因素[12]。目前研究與膀胱癌有關(guān)的基因有RB1、Ha-ras、CK19-Tag、Nrf-2、p53、Pten、Hras-128、p27、UPⅡ-SV40T等，如p53的缺失與變異可能與膀胱癌發(fā)生有關(guān)[13-15]。

GEM模型在癌癥生物學(xué)研究上應(yīng)用廣泛，例如腫瘤表型的分析、信號通路等，是化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)模型和其他非原位模型的補(bǔ)充[16-17]。傳統(tǒng)的GEM模型建立方法是對整個(gè)動物進(jìn)行基因敲除，例如抑癌基因，但這種方法容易造成胚胎的死亡[18]。因此，目前常用的方法是利用Cre/loxp有選擇的進(jìn)行基因插入和敲除，有報(bào)道利用Upk2啟動子控制下，尿路上皮表達(dá)SV40T抗原建立GEM模型[19]。盡管這類模型為研究膀胱癌提供了很好的平臺，但也存在如下缺點(diǎn)：第一，缺乏腫瘤的異質(zhì)性，可能影響腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移；第二，與其他癌癥相比,膀胱癌在很大程度上是弱勢的GEM模型，大多數(shù)現(xiàn)有的GEM模型表現(xiàn)為非浸潤性，這可能由于多數(shù)基因改變，甚至許多組合變化是相對溫和的表型，同時(shí)阻礙了膀胱癌GEM模型的使用[20]。

三、細(xì)胞系移植瘤模型

膀胱腫瘤細(xì)胞在免疫缺陷的小鼠或大鼠體內(nèi)，能夠原位移植到膀胱內(nèi)產(chǎn)生腫瘤，早在1975年就報(bào)道過利用膀胱腫瘤細(xì)胞移植于膀胱建立膀胱癌模型[21]。目前主要方法是將裸鼠麻醉后，暴露膀胱，利用物理方法損傷膀胱黏膜，將腫瘤細(xì)胞懸液灌注膀胱，結(jié)扎尿道，2 h后解除結(jié)扎，恢復(fù)排尿。張琦等[22]使用留置針機(jī)械摩擦損傷膀胱黏膜，人膀胱癌細(xì)胞懸液暴露的方法建立膀胱癌原位腫瘤模型。也有經(jīng)尿道插入導(dǎo)管灌入腫瘤細(xì)胞的，但由于解剖上的差異，此方法易于在雌性動物上實(shí)施，同時(shí)延長膀胱灌注的時(shí)間有利于提高建模的成功率[23-24]。

雖然這種模型也用于臨床前的研究，但由于腫瘤細(xì)胞在體外篩選和培養(yǎng)傳代，缺乏腫瘤微環(huán)境，丟失了原有腫瘤的異質(zhì)性，導(dǎo)致許多新的治療方法在臨床前研究與臨床試驗(yàn)實(shí)際療效之間存在差異。

四、人源性移植瘤(patient derived tumor xenograft, PDTX)模型

PDTX模型被認(rèn)為是一個(gè)能夠準(zhǔn)確預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)化療和腫瘤類型的識別情況的模型，可能使新的治療方法更好的應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中。這個(gè)模型的建立是通過使用膀胱癌患者的腫瘤組織直接移植到免疫功能缺陷的動物上，如重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)鼠或裸鼠。因?yàn)樗鼈冎苯觼碜曰颊叩哪[瘤樣本，所以移植后保留了原始腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子標(biāo)志物。因此，膀胱癌PDTX模型具有原始腫瘤的生物學(xué)特性并且適用于評價(jià)個(gè)體患者的腫瘤化學(xué)敏感性，這不僅是一個(gè)臨床試驗(yàn)的平臺，更提供了一個(gè)潛在的指導(dǎo)臨床治療的決策性工具[25-27]。

膀胱癌PDTX模型對研究腫瘤的生物學(xué)特征和評估新的抗癌藥物是否可以進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)階段，都具有重要價(jià)值。在新藥的臨床前評價(jià)上，最早是使用人類膀胱腫瘤細(xì)胞系建立的模型，而膀胱癌PDTX模型只是被用作傳統(tǒng)腫瘤模型的補(bǔ)充部分。但是源于細(xì)胞系的體內(nèi)模型由于缺乏原始腫瘤的結(jié)構(gòu)，容易導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生新的特點(diǎn)和亞型，影響新藥的療效，而對膀胱癌PDTX模型而言，患者的腫瘤組織樣本經(jīng)過簡單的處理，直接植入小鼠，可以更好地保留原始腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子標(biāo)記[28-29]，提高模型與患者一致性，也使得膀胱癌PDTX模型應(yīng)用更加廣泛。

1.膀胱癌PDTX模型的建立方法：①標(biāo)本收集：在無菌條件下，切取患者部分(根據(jù)腫瘤大小而定)離體腫瘤組織，盡可能選取腫瘤邊緣壞死較少的部分組織，將其完全浸泡于4 ℃無血清含雙抗的PRMI 1640培養(yǎng)液中。清洗后轉(zhuǎn)移到含培養(yǎng)液的消毒培養(yǎng)皿中(4 ℃)，完全浸泡標(biāo)本。②移植：用以上培養(yǎng)液清洗腫瘤組織3遍后，用滅菌組織剪將腫瘤組織修剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，并與基質(zhì)膠混勻。麻醉6周齡的雌性SCID鼠或裸鼠，用套管針將腫瘤組織植入到小鼠背側(cè)皮下[30-31]。

2.膀胱癌PDTX模型面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)：PDTX模型雖然已經(jīng)建立了幾十年，但也是最近才開始用于癌癥治療的評估。目前開發(fā)的PDTX人類癌癥模型有許多種，如前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等，這些模型與原始腫瘤的一致性已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[32-35]。

保持腫瘤樣本的異質(zhì)性是異種移植的一個(gè)優(yōu)勢，它的建立和發(fā)展較細(xì)胞系移植模型能更好地反映人類腫瘤的特點(diǎn)。然而，異種移植的腫瘤樣本不僅包括不同的腫瘤細(xì)胞，還包括細(xì)胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞、壞死等，這就可能導(dǎo)致不同的腫瘤移植成功率不同，甚至是成功率較低。雖然使用分選的細(xì)胞或原代細(xì)胞培養(yǎng)可以提高移植的成功率，但由于缺乏原始腫瘤的微環(huán)境，使得這些簡化的人造腫瘤會影響臨床預(yù)測的結(jié)果。

PDTX模型建立的成功率低以及達(dá)到適合藥物測試所需模型數(shù)量的時(shí)間長、缺乏一致性是其主要的局限性。成功植入小鼠是關(guān)鍵的第一步，增加移植小鼠和植入腫瘤組織的數(shù)量、多部位移植、加入基質(zhì)膠等有可能提高成功率。連續(xù)的PDTX模型傳代是另一重要方面，通過這種方法能達(dá)到足夠的數(shù)量進(jìn)行藥物測試。第一批接受患者腫瘤組織的小鼠數(shù)量不是固定的，取決于腫瘤樣本的數(shù)量，同時(shí)應(yīng)減少使用過細(xì)的注射器，這可能會對腫瘤組織的結(jié)構(gòu)造成較大破壞。

PDTX模型的另一個(gè)局限性是由于動物的免疫系統(tǒng)和藥物代謝途徑可能不同于人類，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)的腫瘤反應(yīng)和臨床患者之間的一致性有待評估;同時(shí)需要考慮到移植的腫瘤組織所需營養(yǎng)和血液由小鼠供應(yīng)，可能導(dǎo)致小鼠發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的概率較小。目前這方面的報(bào)道較少，尚需要進(jìn)一步的研究。

近些年來已有大規(guī)模的人類腫瘤PDTX模型項(xiàng)目逐漸開展，但是不同腫瘤組織的預(yù)測能力并不一致，例如，模型顯示肺癌和卵巢癌有良好的預(yù)測價(jià)值，但乳腺癌和結(jié)腸癌未能得到好的效果[36]。雖然膀胱癌PDTX模型能夠保留原始腫瘤的組織學(xué)和分子結(jié)構(gòu)，具有很多優(yōu)勢，但是這種模型在臨床上的預(yù)測價(jià)值仍缺乏研究，這也是需要我們繼續(xù)探索的。

五、總結(jié)和展望

隨著我國人口老齡化的加劇，膀胱癌的發(fā)病率也有所上升，鑒于膀胱癌在治療上帶來的巨大社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，能夠真實(shí)反映患者情況的膀胱癌體內(nèi)模型具有重要的臨床價(jià)值。本文小結(jié)了幾種常用的膀胱癌體內(nèi)模型，各模型之間各有利弊，如何更好地利用這些模型為患者提供有效的個(gè)體化治療方案并降低醫(yī)療成本，這需要我們所有科研人員共同努力。

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(本文編輯：熊鈺芬)

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