慢病毒介導核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導激酶和IκB激酶連接蛋白基因沉默對人結(jié)腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響▲

梁夢紫 黃杰安 劉詩權 覃蒙斌 彭 鵬 諸葛春鳳 徐春燕 李 倩 陳楚杰

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院西院消化內(nèi)科，南寧市 530007，E-mail：337001572@qq.com)

論著·基礎研究

慢病毒介導核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導激酶和IκB激酶連接蛋白基因沉默對人結(jié)腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響▲

梁夢紫 黃杰安 劉詩權 覃蒙斌 彭 鵬 諸葛春鳳 徐春燕 李 倩 陳楚杰

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院西院消化內(nèi)科，南寧市 530007，E-mail：337001572@qq.com)

目的 探討慢病毒介導的核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導激酶 和 IκB 激酶連接蛋白(NIBP)基因沉默后對人結(jié)腸癌HCT116細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法 通過DNA重組技術，進行設計并構(gòu)建人NIBP基因的慢病毒載體以及無關序列的Lenti-EGFP慢病毒載體，感染HCT116細胞后分別為轉(zhuǎn)染組(NIBP-RNAi組)和陰性對照組(NC組)，而未予轉(zhuǎn)染處理的HCT116細胞則為空白對照組(CON組)。將實驗分為非腫瘤壞死因子-α(TNF-α)組和TNF-α組：非TNF-α組包括NIBP-RNAi組、NC組、CON組，TNF-α組包括NIBP-RNAi+TNF-α組(NIBP-RNAi+組)、NC+TNF-α組(NC+組)、CON+TNF-α組(CON+組)，其中TNF-α組均予TNF-α進行干預。檢測非TNF-α組NIBP mRNA及蛋白的表達情況，以及各組上皮性鈣黏附分子(E-cadherin)和神經(jīng)性鈣黏附分子(N-cadherin) mRNA及蛋白的表達；采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)的變化。結(jié)果 NIBP-RNAi組NIBP的mRNA 及蛋白表達均顯著低于NC組及CON組(P<0.05)；與CON組比較，CON+組、NC+組的細胞發(fā)生明顯的EMT，E-cadherin的mRNA和蛋白的表達均明顯降低、N-cadherin的mRNA和蛋白的表達均明顯上升(P<0.05)，NIBP-RNAi組及NIBP-RNAi+組的細胞由間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ぜ毎螒B(tài)，E-cadherin的mRNA和蛋白的表達均明顯上升、N-cadherin的mRNA和蛋白的表達均明顯降低(P<0.05)；而CON組和NC組比較，以及CON+組和NC+組E-cadherin及N-cadherin 的mRNA和蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計意義(P>0.05)。結(jié)論 靶向下調(diào)NIBP基因表達可抑制人結(jié)腸癌HCT116細胞EMT的發(fā)生。

結(jié)腸癌；核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導激酶 和 IκB 激酶連接蛋白；腫瘤壞死因子-α；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；慢病毒

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素相互作用的結(jié)果，預后主要與侵襲轉(zhuǎn)移與否有關。因此，早期防治結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移是改善預后的關鍵。目前研究發(fā)現(xiàn)， 核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導激酶和IκB 激酶連接蛋白(nuclear factor κB-inducing kinase and Iκβ kinase binding protein，NIBP)基因，是核轉(zhuǎn)錄因子-κB誘導激酶(nuclear factor κB-inducing kinase，NIK)/IκB 激酶(Iκβ kinase，IKK)/轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB，NF-кB)信號通路中的一類可將NF-кB的非經(jīng)典途徑關鍵酶-NIK與經(jīng)典途徑關鍵激活子-IKKβ連接成三聚體的支架蛋白。NIBP在NF-кB經(jīng)典通路的激活劑腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作用下可增強腫瘤細胞的侵襲能力[1-2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞通過特定的程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞樣表型的生物學過程[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EMT是許多惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制[4]。

國外研究報告，NF-кB信號通路可通過誘導轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達從而抑制細胞上皮標志物上皮細胞鈣黏附分子(E-cadherin)的表達，使細胞間黏附缺失，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞HK-2和單核細胞共培養(yǎng)后，可通過NF-кB信號通路上調(diào)細胞間黏附分子-1的表達，使E-cadherin的表達下降，纖維連接蛋白(Fibronectin)表達增加，從而誘導HK-2細胞EMT的發(fā)生[6]。Zhu等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，在人胃癌細胞中用南蛇藤提取物進行干預后，能有效抑制由轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導的EMT現(xiàn)象，同時在TNF-α作用下的NF-кB信號通路的活化程度也受到抑制。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，NF-кB在不同活化狀態(tài)下可影響結(jié)腸癌細胞的EMT發(fā)生[8]。而有關NIBP基因沉默后在人結(jié)腸癌細胞EMT中的作用和機制的研究尚未見報告。因此，我們擬通過慢病毒介導NIBP基因沉默，觀察NIBP基因沉默后對人結(jié)腸癌HCT116細胞株 EMT的影響，為結(jié)腸癌的靶向治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及實驗分組：人結(jié)腸癌HCT116細胞購自上海中國科學院；實驗分為非TNF-α組和TNF-α組，非TNF-α組包括未轉(zhuǎn)染處理的HCT116細胞組(CON組)、以無關序列的Lenti-EGFP慢病毒載體感染HCT116細胞的陰性對照組(NC組)以及含有人NIBP基因的慢病毒載體感染HCT116細胞的轉(zhuǎn)染組(NIBP-RNAi組)；TNF-α組包括CON加TNF-α組(CON+組)、NC加TNF-α組(NC+組)以及NIBP-RNAi加TNF-α組(NIBP-RNAi+組)，TNF-α的終濃度為20 ng/mL，均培養(yǎng)4 d。1.1.2 實驗試劑：重組慢病毒載體均由美國Invitrogen公司構(gòu)建；TNF-α購自美國Sigma-Aldrich公司(批號：SLBJ0062V)；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(批號：0112)、NIBP(批號：0003)、E-cadherin(批號：0020)和神經(jīng)性鈣黏附分子(N-cadherin，批號：0001)單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；IRDye800標記的羊抗兔二抗購自LI-COR公司；RNAsio、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)均購自日本TaKaRa Biotechnology公司(批號：AK6503)；PCR引物設計及合成由TaKaRa Biotechnology公司合成；胎牛血清購于美國ExCell公司(批號：420820)；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購于美國Gibco公司(批號:8114437)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人結(jié)腸癌HCT116細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，并選用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 慢病毒介導穩(wěn)定下調(diào)NIBP表達：取對數(shù)生長期人結(jié)腸癌HCT116細胞按5×104個/孔接種于24孔板，另取一孔加入HEK293T細胞(購自上海中國科學院)作為對照，取出低溫保存的病毒液溶化后與培養(yǎng)基混合，加入培養(yǎng)孔內(nèi)，同時加入8 μg/ml聚凝胺提高感染效率，第2天后開始觀察細胞的感染效率。加入殺稻瘟菌素(blasticidin，BSD)篩選，挑選單克隆進行傳代培養(yǎng)，建立穩(wěn)定干擾的NIBP表達的HCT116細胞，再進行后續(xù)實驗。1.2.3 熒光實時定量-PCR檢測：檢測非TNF-α組NIBP mRNA的表達情況，以評價NIBP的沉默效率，同時檢測各組細胞E-cadherin和N-cadherin基因mRNA的相對表達量。非TNF-α組加等量的培養(yǎng)基，TNF-α組加含TNF-α的等量培養(yǎng)液，TNF-α的終濃度為20 ng/ml，均培養(yǎng)4 d后將細胞收集，并采用RNAsio試劑法提取各組細胞總RNA，采用分光光度計檢測RNA濃度及純度。均各取1 μg總RNA按反轉(zhuǎn)錄說明書合成cDNA備用。各基因根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)提供的序列，設計引物見表1。QRT-PCR反應條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，72℃ 45 s，40個循環(huán)，72℃ 7 min，熒光信號檢測。以GAPDH作為內(nèi)參照，每個基因的每個樣品設3個重復擴增管。實驗重復3次，數(shù)據(jù)采用相對雙△Ct法，按公式2-△△Ct行定量分析。

表1 相關基因的引物序列

1.2.4 Western Blot檢測：檢測非TNF-α組NIBP蛋白表達情況，以評價NIBP的沉默效率，同時檢測各組細胞E-cadherin和N-cadherin基因蛋白的表達量。非TNF-α組加等量的培養(yǎng)基，TNF-α組加含TNF-α的等量培養(yǎng)液，TNF-α的終濃度為20 ng/ml，均培養(yǎng)4 d后將細胞收集，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟，冰上靜置30 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清移至新的離心管中，聚氰基丙烯酸正丁酯法測蛋白濃度， 沸水煮5 min后每孔上樣300 ng，經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏(二)氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別加兔抗人NIBP、E-cadherin、N-cadherin單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗人GAPDH抗體(1 ∶1 000) 4 ℃過夜，吐溫磷酸緩沖鹽溶液(Tween 20-phosphate-buffered saline，TBST)洗滌后，IRDye 800標記的羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌后，采用LI-COR公司 Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參照對E-cadherin、N-cadherin進行灰度值分析。

1.2.5 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)：取對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成合適濃度的細胞懸浮液，并接種至6孔板中，貼壁后按實驗設計，非TNF-α組加等量的培養(yǎng)基，TNF-α組加含TNF-α的等量培養(yǎng)液，TNF-α的終濃度為20 ng/ml，均培養(yǎng)4 d，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以上實驗均重復3次，計量數(shù)據(jù)以(x±s)表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 非TNF-α組NIBP mRNA及蛋白的表達情況 轉(zhuǎn)染細胞后，NIBP-RNAi組細胞中NIBP的mRNA相對表達量及蛋白表達水平均顯著低于CON組及NC組(P<0.05)，見表2、3及圖1。

表2 CON組、NC組、NIBP-RNAi組的NIBP基因mRNA相對表達量(n=3，x±s)

注：與NIBP-RNAi組比較，*P<0.05。

表3 CON組、NC組、NIBP-RNAi組的NIBP基因蛋白的表達量(n=3， x±s)

注：與NIBP-RNAi組比較，*P<0.05。

圖1 HCT116細胞中NIBP基因蛋白的表達

2.2 各組細胞E-cadherin和N-cadherin基因mRNA相對表達量的比較 與CON組比較，經(jīng)20 ng/ml TNF-α干預后的CON+組、NC+組E-cadherin的mRNA表達量明顯降低、N-cadherin的mRNA表達量明顯上升(P<0.05)，NIBP-RNAi組及NIBP-RNAi+組E-cadherin的mRNA表達量上升、N-cadheri的mRNA表達量降低(P<0.05)，其中NIBP-RNAi組的表達上升或降低尤為明顯；而CON組和NC組比較，以及CON+組和NC+組比較，差異均無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組細胞中E-cadherin和N-cadherin在mRNA水平的相對表達量(x±s)

注：與CON組相比，*P<0.05、#P>0.05；與CON+組相比，△P>0.05。

2.3 各組細胞中E-cadherin和N-cadherin基因蛋白表達量的比較 與CON組比較，經(jīng)20 ng/ml TNF-α干預后的CON+組、NC+組E-cadherin的蛋白表達量明顯降低、N-cadherin的蛋白表達量明顯上升(P<0.05)，NIBP-RNAi組及NIBP-RNAi+組E-cadherin的蛋白表達量上升，N-cadherin的蛋白表達量降低(P<0.05)，其中NIBP-RNAi組的表達上升或降低尤為明顯；而CON組和NC組比較，以及CON+組和NC+組比較，差異均無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見圖2、表5。

2.4 倒置相差顯微鏡觀察在TNF-α干預前后細胞的形態(tài)變化 倒置相差顯微鏡顯示，CON組和NC組的細胞大多數(shù)呈多邊形，可見絲狀偽足，細胞間連接較疏松但仍存在一定的緊密連接；而NIBP-RNAi組的細胞形態(tài)變圓，絲狀偽足明顯減少，細胞間連接緊密；經(jīng)TNF-α干預后，可明顯促進細胞的EMT形態(tài)的發(fā)生，CON+組和NC+組的細胞為細長形，可見細長的絲狀偽足增多，細胞間排列更疏松；而NIBP-RNAi +組中可見有偽足不明顯、多角形、細胞間排列緊密的細胞，也可見少量具有細長絲狀偽足的細胞。見圖3。

圖2 各組細胞E-cadherin、N-cadherin蛋白水平的相對表達量

注：1、CON組；2、NC組；3、NIBP-RNAi組；4、CON+組；5、NC+組；6、NIBP-RNAi+組。

表5 各組細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達量(x±s)

注：與CON組相比，*P<0.05、#P>0.05；與CON+組相比，△P>0.05。

圖3 倒置相差顯微鏡觀察各組HCT116細胞的形態(tài)(×100)

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)病率分別居于男、女性惡性腫瘤的第三位及第二位[9]。隨著生活水平的提高及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年增長的趨勢，給人們的健康與生命帶來嚴重威脅。影響結(jié)腸癌預后的最主要的因素為是否轉(zhuǎn)移，然而目前能預測結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的臨床指標尚未明確。

NIBP基因是2005年在人神經(jīng)細胞中檢測出的一種NF-кB信號通路的調(diào)節(jié)因子，能將NIK與IKK結(jié)合成三聚體從而增強NF-кB的活性作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，NIK/IKK/NF-кB信號通路在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中均起著重要作用[10-11]。其目前公認的激活途徑主要為兩條途徑，即在外部刺激因子如TNF-α作用下，NIK促使IKKβ磷酸化后進一步使NF-кB二聚體得以釋放，從而啟動核轉(zhuǎn)錄程序的經(jīng)典途徑[12]；以及通過NIK與IKKα結(jié)合并磷酸化后將p100加工成p52，再進入細胞核發(fā)揮作用的非經(jīng)典途徑[13]。NIK對促進這兩條途徑的激活至關重要。而IKK是NF-кB信號通路的關鍵激酶，其包括的兩個催化亞基IKKα和IKKβ均與NIK結(jié)合后而發(fā)揮激活作用。最新研究表明，NIBP廣泛表達于大多數(shù)腫瘤組織中，特別是在乳腺癌和結(jié)腸癌，并可能通過NF-кB信號通路的活化促進腫瘤的發(fā)生[14]。在NF-кB經(jīng)典途徑激活劑TNF-α的作用下，NIBP還可增強腫瘤細胞的侵襲能力[1，13-14]。此外，在人結(jié)腸癌組織中NIBP表達明顯上調(diào)并參與腺瘤發(fā)展為腺癌的過程[15]。本課題組前期采用免疫組化方法檢測人結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織中的NIBP、p-p100、p52、CD44、波形蛋白和E-cadherin的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NIBP、p-p100、p52、CD44、波形蛋白在人結(jié)直腸癌組織中的表達均高于結(jié)腸腺瘤及正常腸黏膜，而E-cadherin表達結(jié)果相反，因此，我們推測NIBP可能也通過激活NF-кB信號非經(jīng)典途徑誘導EMT的發(fā)生[16]。本文主要針對NIBP與人結(jié)腸癌細胞EMT的關系進行探討。

EMT是上皮細胞通過特定的程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞樣表型的生物學過程。近年來研究表明，EMT是腫瘤細胞具有遷移、侵襲能力的重要基礎[17-18]。EMT在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用，其具有高抗凋亡能力并能使細胞內(nèi)相關蛋白表達的改變[3，7，19]。EMT最基本的特征是上皮組織細胞的特征性丟失，同時伴有間質(zhì)細胞的特征性存在。發(fā)生EMT后，表現(xiàn)為上皮細胞的細胞間緊密連接消失，細胞由多邊形鵝卵石樣變?yōu)樗笮蔚睦w維細胞樣形態(tài)；細胞失去極性，黏附能力下降，具有較強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[20-21]；細胞的上皮標志物如E-cadherin表達下降；而細胞的間質(zhì)標志物如N-cadherin、波形蛋白等表達增加，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、ZEB、Twist等表達上調(diào)[22]。其中E-cadherin是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移較重要的一種蛋白，同時也是EMT的關鍵分子。其表達下調(diào)或抑制和功能喪失都可以啟動EMT[23]，而EMT早期最重要的過程，是鈣黏素E-cadherin和N-cadherin之間的轉(zhuǎn)換。

在本研究中，轉(zhuǎn)染細胞后，NIBP-RNAi組細胞中NIBP的mRNA相對表達量及蛋白表達水平均顯著低于CON組及NC組(P<0.05)，提示了通過慢病毒載體可有效地介導人結(jié)腸癌HCT116細胞NIBP基因的沉默。同時也發(fā)現(xiàn)，NIBP-RNAi組細胞下調(diào)NIBP表達后，人結(jié)腸癌HCT116細胞由輕微的EMT形態(tài)，即多邊形或梭形、可見絲狀偽足、細胞間連接較為疏松但仍存在一定緊密連接的過渡期細胞形態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形、絲狀偽足明顯減少、細胞間連接緊密的上皮細胞形態(tài)；而NC組的細胞形態(tài)與CON組比較無明顯改變。目前已知，TNF-α是NF-кB經(jīng)典通路的激活劑，其可通過促進NF-кB的激活，進而誘導許多腫瘤EMT的發(fā)生。我們的前期研究也證實了TNF-α可活化NF-кB，使P-p65表達增加，從而促進結(jié)腸癌細胞的EMT[10]。本實驗采用TNF-α進行干預后，CON+組和NC+組均出現(xiàn)明顯的EMT現(xiàn)象，細胞呈現(xiàn)間充質(zhì)樣的細長紡錘形、可見明顯的細長形絲狀偽足增多，細胞散在生長；而NIBP-RNAi +組中偽足不明顯、類圓形、排列緊密的上皮樣細胞以及少量具有細長絲狀偽足的間質(zhì)樣細胞并存著。我們還采用熒光實時定量-PCR和Western Blot分別檢測各組細胞的上皮標志物E-cadherin和間質(zhì)標志物N-cadherin的mRNA及蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，與CON組及NC組對比，經(jīng)TNF-α干預后的CON+組、NC+組E-cadherin的明顯減少、N-cadherin明顯增加(P<0.05)；而無論有無TNF-α干預的影響，下調(diào)NIBP表達后的NIBP-RNAi組及NIBP-RNAi+組細胞的E-cadherin均顯著上升，N-cadherin均顯著降低(P<0.05)，其中在未進行TNF-α干預的NIBP-RNAi組的表達上升或降低尤為明顯，可能與TNF-α還可通過p38/激活絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)[24]以及蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3β)[25]等信號通路促進結(jié)腸癌細胞的EMT和侵襲轉(zhuǎn)移有關。以上結(jié)果提示，沉默NIBP基因的表達在一定程度上可逆轉(zhuǎn)HCT116細胞的EMT現(xiàn)象。目前研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腸道神經(jīng)細胞中沉默NIBP的表達后可抑制由TNF-α誘導的NF-кB的活化[4]。而增加NIBP在人乳腺癌或人結(jié)腸癌細胞中的表達可增強TNF-α誘導激活NF-кB的能力；反之，下調(diào)NIBP的表達后明顯抑制了腫瘤細胞生長及TNF-α誘導的凋亡[14]。因此我們推測，NIBP可能通過激活NF-кB經(jīng)典信號通路從而促進結(jié)腸癌細胞EMT的發(fā)生。

綜上所述，應用慢病毒靶向介導沉默NIBP表達可抑制結(jié)腸癌EMT的發(fā)生，在某種程度上可能減弱由EMT引起的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力，且下調(diào)NIBP表達可能在抑制由TNF-α誘導NF-кB信號通路的活化從而引起EMT發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用。這一發(fā)現(xiàn)可能為尋找抑制結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶點及臨床治療提供新的思路。

[1] Hu WH,Pendergast JS,Mo XM,et al.NIBP,a novel NIK and IKK beta-binding protein that enhances NF-kappa B activation[J].J Biol Chem,2005,280(32):29 233-29 241.

[2] Zhang Y,Bitner D,Pontes Filho AA,et al.Expression and function of NIK-and IKK2-binding protein (NIBP) in mouse enteric nervous system[J].Neurogastroenterol Motil,2014,26(1):77-97.

[3] Zhang Z,Liu ZB,Ren WM,et al.The miR-200 family regulates the epithelial-mesenchymal transition induced by EGF/EGFR in anaplastic thyroid cancer cells[J].Int J Mol Med,2012,30(4):856-862.

[4] Chen X,Halberg RB,Burch RP,et al.Intestinal adenomagenesis involves core molecular signatures of the epithelial-mesenchymal transition[J].J Mol Histol,2008,39(3):283-294.

[5] Wellner U,Schubert J,Burk UC,et al.The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemness-inhibiting microRNAs[J].Nat Cell Biol,2009,11(12):1 487-1 495.

[6] Li Q,Liu BC,Lv LL,et al.Monocytes induce proximal tubular epithelial-mesenchymal transition through NF-kappa B dependent upregulation of ICAM-1[J].J Cell Biochem,2011,112(6):1 585-1 592.

[7] Zhu Y,Liu Y,Qian Y,et al.Research on the efficacy of Celastrus Orbiculatus in suppressing TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition by inhibiting HSP27 and TNF-α-induced NF-κ B/Snail signaling pathway in human gastric adenocarcinoma[J].BMC Complement Altern Med,2014,14:433.

[8] 劉寶玉,黃杰安,劉詩權,等.NF-κB對人結(jié)腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的影響[J].世界華人消化雜志,2014,22(23):3 403-3 409.

[9] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[10]Staudt LM.Oncogenic activation of NF-kappa B[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2(6):a000109.

[11]Wu Y,Zhou BP.TNF-alpha/NF-kappaB/Snail pathway in cancer cell migration and invasion[J].Br J Cancer,2010,102(4):639-644.

[12]Malinin NL,Boldin MP,Kovalenko AV,et al.MAP3K-related kinase involved in NF-kappaB induction by TNF,CD95 and IL-1[J].Nature,1997,385(6616):540-544.

[13]Xiao G,Harhaj EW,Sun SC.NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100[J].Mol Cell,2001,7(2):401-409.

[14]Zhang Y,Liu S,Wang H,et al.Elevated NIBP/TRAPPC9 mediates tumorigenesis of cancer cells through NFκB signaling[J].Oncotarget,2015,6(8):6 160-6 178.

[15]Kim JC,Kim SY,Roh SA,et al.Gene expression profiling:canonical molecular changes and clinicopathological features in sporadic colorectal cancers[J].World J Gastroenterol,2008,14(43):6 662-6 672.

[16]譚 林,劉詩權,覃蒙斌,等.NIBP在結(jié)腸癌NF-κB非經(jīng)典激活通路中的作用及其臨床意義[J].世界華人消化雜志,2015,23(8):1 238-1 246.

[17]Bonnomet A,Brysse A,Tachsidis A,et al.Epithelial-to-mesenchymal transitions and circulating tumor cells[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2010,15(2):261-273.

[18]De Craene B,Berx G.Regulatory networks defining EMT during cancer initiation and progression[J].Nat Rev Cancer,2013,13(2):97-110.

[19]Yang J,Weinberg RA.Epithelial-mesenchymal transition:at the crossroads of development and tumor metastasis[J].Dev Cell,2008,14(6):818-829.

[20]Micalizzi DS,Farabaugh SM,Ford HL.Epithelial-mesenchymal transition in cancer:parallels between normal development and tumor progression[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2010,15(2):117-134.

[21]Tam WL,Weinberg RA.The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer[J].Nat Med,2013,19(11):1 438-1 449.

[22]Sleeman JP,Thiery JP.SnapShot:The epithelial-mesenchymal transition[J].Cell,2011,145(1):162.

[23]Gravdal K,Halvorsen OJ,Haukaas SA,et al.A switch from E-cadherin to N-cadherin expression indicates epithelial to mesenchymal transition and is of strong and independent importance for the progress of prostate cancer[J].Clin Cancer Res,2007,13(23):7 003-7 011.

[24]Bates RC,Mercurio AM.Tumor necrosis factor-alpha stimulates the epithelial-to-mesenchymal transition of human colonic organoids[J].Mol Biol Cell,2003,14(5):1 790-1 800

[25]Wang H,Wang HS,Zhou BH,et al.Epithelial-mesenchymal transition (EMT) induced by TNF-α requires AKT/GSK-3β-mediated stabilization of snail in colorectal cancer[J].PLoS One,2013,8(2):e56 664.

Effect of lentivirus-mediated nuclear factor κB-inducing kinase and Iκβ kinase binding protein gene silencing on epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer cells

LIANGMeng-zi,HUANGJie-an,LIUShi-quan,QINMeng-bin,PENGPeng,ZHUGEChun-feng,XUChun-yan,LIQian,CHENChu-jie

(DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effect of lentivirus-mediated nuclear factor κB-inducing kinase and Iκβ kinase binding protein(NIBP) gene silencing on epithelial-mesenchymal transition(EMT) of human colon cancer cell line HCT116.Methods Using recombination DNA technique,NIBP gene lentivirus vector and unrelated sequence lentivirus vector(Lenti-EGFP) were designed and established,and then were transfected into HCT116 cells,which were defined as transfection group(NIBP-RNAi group) and negative control(NC) group.The HCT116 cells without transfection were enrolled as blank control group(CON group).This experiment consisted of non-tumor necrosis factor-α(TNF-α) group and TNF-α group.Non-TNF-α group included NIBP-RNAi group,NC group and CON group,and TNF-α group included NIBP-RNAi+TNF-α group(NIBP-RNAi+group),NC+TNF-α group(NC+group) and CON+TNF-α group(CON+group).And TNF-α group was treated with TNF-α.The expressions of NIBP mRNA and protein were detected in non-TNF-α group.And the mRNA and protein expressions of E-cadherin and N-cadherin were detected in each group.Phase-contrast microscope was used to observe the changes of cell morphology in each group.Results The expressions of NIBP mRNA and protein in NIBP-RNAi group were significantly lower than those in NC group or CON group(P<0.05).CON+group and NC+group obtained obvious EMT in the cells,significantly lower expressions of E-cadherin mRNA and protein,and significantly higher expressions of N-cadherin mRNA and protein compared to CON group(P<0.05).In NIBP-RNAi group and NIBP-RNAi+group,the shape of cells changed from the shape of mesenchymal cell to the shape of epithelial cell,and the expressions of E-cadherin mRNA and protein significantly increased,and the expressions of N-cadherin mRNA and protein significantly reduced compared to CON group(P<0.05).But there were no significant differences in mRNA and protein expressions of E-cadherin and N-cadherin between CON+group and NC+group,or CON group and NC group(P>0.05).Conclusion Targeted down-regulation of NIBP expression can inhibit the incidence of EMT in human colon cancer cell line HCT116.

Colon carcinoma,Nuclear factor κB-inducing kinase and Iκβ kinase binding protein,Tumor necrosis factor-α,Epithelial-mesenchymal transition,Lentivirus

國家自然科學基金(81260365)

梁夢紫(1989～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤分子機制。

黃杰安(1965～)，男，博士，教授，研究方向：消化道腫瘤分子機制，E-mail：1404991727@qq.com。

R 34；R 735.3

A

0253-4304(2016)06-0753-06

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.01

2016-02-24

2016-04-30)