內皮祖細胞對藥物洗脫支架置入術后再狹窄及再內皮化影響的研究進展

孫文博　王　賀　司春嬰　解金紅　陳玉善　柴爽爽　關懷敏.河南中醫(yī)藥大學研究生處，河南鄭州450000；.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)：心臟中心，河南鄭州450000

內皮祖細胞對藥物洗脫支架置入術后再狹窄及再內皮化影響的研究進展

孫文博1王賀2司春嬰2解金紅2陳玉善2柴爽爽2關懷敏2
1.河南中醫(yī)藥大學研究生處，河南鄭州450000；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)：心臟中心，河南鄭州450000

經皮冠狀動脈介入治療是目前治療冠心病的主要手段，但支架內再狹窄嚴重影響了其長期療效。研究發(fā)現，支架內再狹窄的發(fā)生主要與內皮損傷、再內皮化延遲有關?？焖偻耆脑賰绕せ穷A防支架內再狹窄的重要方法。而內皮祖細胞在受損內皮再修復的過程中起重要作用，有研究發(fā)現通過促進內皮祖細胞動員、移植內皮祖細胞或者捕獲循環(huán)中的內皮祖細胞等方式，促進其增殖、遷移、分化及歸巢，可以加速受損血管的再內皮化，這為有效防止支架內再狹窄提供了一個很好的研究方向。

內皮祖細胞；支架內再狹窄；再內皮化

［Avsteact］Percutaneous coronary intervention is themajormeans in the treatment of coronary heart disease，but instent restenosis seriously affect its long-term efficacy.Studies have found that the occurrence of in-stent restenosis is mainly associated with endothelial injury and the delay of re-endothelialization.Fast and complete re-endothelial is an importantway to prevent stent re-stenosis.While，endothelial progenitor cells play an important role in the process of endothelial repair.A study has provided a good research direction to effectively prevent the in-stent restenosis.It is confirmed that promoting endothelial progenitor cellsmobilization，transplantation of endothelial progenitor cells or capture circulating endothelial progenitor cells，and promoting its proliferation，migration，differentiation and homing，can accelerate re-endothelialization of damaged blood vessels.

［Key woeds］Endothelial progenitor cells；In-stent restenosis；Re-endothelialization

經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前治療冠心病的主要手段，顯著地改善了冠心病患者的臨床預后。但是雖然冠狀動脈內支架不斷改進，術后抗血小板藥物應用也越來越廣泛，但是PCI的術后并發(fā)癥——支架內再狹窄的發(fā)生率依然高達12%［1］，是影響支架遠期療效的主要因素。大量研究表明支架內再狹窄的原因主要是內皮損傷，再內皮化延遲，導致炎性反應，平滑肌細胞及細胞外基質過度增殖，形成新的內膜。內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，血管損傷后定向遷移至受損血管處，增殖、分化為血管內皮細胞，修復受損血管內皮，在血管損傷反應中起到重要作用［2］，為有效防止支架內再狹窄提供了一個很好的研究方向。因此，通過修復內皮細胞，促進支架后再內皮化是預防和解決支架內再狹窄最有效的方法［3］。

1　PCI術后血管損傷及支架內再狹窄

支架內再狹窄（in-stent restenosis，ISR）是指冠狀動脈支架置入術后8～12個月冠脈造影顯示支架內或邊緣5 mm內的血管狹窄大于50%，伴或不伴有相關臨床癥狀或心血管事件［4］。

正常的血管內皮細胞能夠分泌多種活性物質來維持血管生理功能穩(wěn)態(tài)。而行經皮冠狀動脈腔內成形術（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）或者金屬支架植入后，引發(fā)內皮損傷，內皮細胞的單層完整性被破壞，內皮下膠原纖維暴露，啟動外源性與內源性凝血系統(tǒng)，激活血小板，引起血小板黏附、聚集繼而形成富含血小板的血栓，從而引起再狹窄的發(fā)生。此外血管損傷也會激發(fā)炎性反應，引起淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等炎癥細胞聚集并釋放炎癥因子［如白細胞介素（IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子（TNF）-α等］和細胞因子（如內皮素、C反應蛋白等）等引起平滑肌細胞增殖、遷移及細胞外基質的沉積，導致再狹窄的進一步加重［5-10］。Zhang等［11］的研究也提示了支架內再狹窄的發(fā)生與炎性反應密不可分。因此，內皮受損是PCI術后再狹窄發(fā)生的始動因素。雖然近年來藥物洗脫支架的使用明顯減少了再狹窄的發(fā)生［12］，但這一問題依然存在［13］，并成為影響PCI術后長期療效的主要因素，因為藥物洗脫支架攜帶的抗增殖藥在抑制新生內膜增殖的同時也抑制了內皮細胞的增殖，導致支架內皮覆蓋不全，進而引起再狹窄和支架內晚期血栓發(fā)生［14］。因此，改善、修復內皮的結構和功能，加速受損血管的再內皮化是解決支架內再狹窄的關鍵［15］。

2　內皮祖細胞的生物學特性

1997年Asahara等［16］采用免疫磁珠吸附法發(fā)現外周血中存在可以分化為血管內皮細胞的造血干細胞，并表達CD34+，他將這種干細胞命名為內皮祖細胞。EPC主要存在于骨髓中，成人的臍帶血中也存在，外周血中也存在極少量的EPC。體外培養(yǎng)EPCs 2～3 d開始貼壁，6～7 d的典型形態(tài)特征是呈“集落”樣生長，以集落為中心放射狀向外生長，形成多個細胞團。集落中央為圓形細胞群，周邊是梭形細胞，逐漸形成“鋪路石”樣結構。培養(yǎng)2周后，大部分內皮祖細胞分化呈多角形，細胞集落相互連接，呈“鋪路石”樣。內皮祖細胞有早期、晚期之分。早期EPC主要以分泌功能為主，分泌細胞因子及相關抗原，晚期內皮祖細胞主要向內皮細胞分化，參與內皮修復［17］。

至今還沒有研究發(fā)現識別EPCs的特異性標志，所以一般細胞鑒定是通過檢測CD34、血管內皮細胞生長因子受體-2（VEGFR-2，也稱KDR、Flk-1）、CD133等。其中CD34被廣泛用于骨髓內皮祖細胞的鑒定，然而也有研究顯示CD34-細胞也可以分化為內皮細胞［18］，所以CD34可能不是最合適的EPC表面抗體。但是目前大多數學者仍認為CD133+、CD34+、VEGFR-2+即為EPC［19］。研究發(fā)現，骨髓中的EPC為CD133+、CD34+、VEGFR-2+細胞，而外周血中的EPC則失去CD133，表達出內皮細胞系的標志如VE-鈣黏蛋白+、內皮型一氧化氮合成酶（endohelial nitric oxide synthase，eNOS）和CD31等。EPC的不同表面標志反映了骨髓內皮祖細胞向內皮細胞分化的不同發(fā)展階段。另一種鑒定方法是雙熒光染色法。EPC體外培養(yǎng)14～21 d行乙?；兔芏戎鞍祝―IL-AC-LDL）和FITC標記的荊豆凝集素Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）雙熒光染色。在激光共聚焦顯微鏡下FITC-UEA-Ⅰ陽性細胞顯綠色，DIL-AC-LDL陽性細胞顯紅色，顯示黃色的雙熒光陽性細胞即為正在分化的內皮祖細胞［20］。

內皮祖細胞主要具有增殖、分化、定向遷移、黏附功能。血管內皮損傷后，外周血中的EPC定向遷移至受損處，黏附聚集并分化為血管內皮細胞，骨髓中的EPCs進入外周血，黏附至血管損傷處，增殖、分化為內皮細胞，參與內皮修復。EPCs還具有分泌細胞因子及生長因子的能力，如IL-8、表皮生長因子（EGF）等，然后作用于自身及鄰近內皮細胞和組織中的祖細胞，從而發(fā)揮內皮樣作用［21］，加速血管再內皮化進程。另外EPCs除了能在內皮生長因子的刺激下分化為成熟血管內皮細胞，也可向血管平滑肌細胞（VSMC）分化［22］。

因此，EPC可以定向遷移黏附于支架處，加速血管再內皮化進程，抑制新生內膜的增生及支架內血栓形成，預防支架內再狹窄。

3　血管損傷后EPCs的作用

目前認為EPCs對促進內皮修復有著巨大作用。成人外周血中的內皮祖細胞的數量非常少，即使在臍帶血中含量也不超過1%。冠心病PCI支架植入造成的內皮損傷可動員骨髓EPCs進入外周血并增殖分化為有功能的內皮細胞，趨化到損傷血管壁參與損傷血管的再內皮化［23］。

Wu等［24］將帶標記的EPC注入球囊損傷頸動脈內皮后的大鼠體內，結果在新生內膜中發(fā)現了熒光標記的EPC。這表明移植EPC可以促進損傷血管再內皮化形成完整的內膜，而且實驗組的新生內膜面積及內膜中膜面積比明顯低于對照組。由此可見，移植的EPC對于快速修復受損內膜、減少新生內膜起到了重要作用。由此可以推斷EPC移植可以應用于PCI術后，減少PCI術后并發(fā)癥的發(fā)生，改善預后，減少心血管不良事件的發(fā)生。

目前，對PCI術后EPC促進內皮修復作用機制的研究主要通過內皮細胞集落形成單位（endothelial cell colony-forming unit，EC-CFUs）來反映［25］。EC-CFUs表現類似內皮細胞的特征，不僅能夠結合凝集素，還能攝取低密度脂蛋白，所以一般認為EC-CFUs源自骨髓源性的EPC。研究發(fā)現：在54例冠狀動脈造影中，行PCI介入手術的患者EC-CFUs水平明顯升高，而單純造影的患者EC-CFUs水平無明顯變化［26］，這可能提示血管損傷會促進骨髓EPC的遷移、增殖以促進受損血管的內皮功能恢復。

4　內皮祖細胞減少再狹窄的治療策略

PTCA或金屬支架植入，引發(fā)內皮損傷，引發(fā)炎性反應；DES由于抑制了內皮細胞的增生，導致了再內皮化的延遲，從而引發(fā)再狹窄的發(fā)生。因此，通過移植內皮祖細胞或者捕獲循環(huán)中的內皮祖細胞，促進其增殖、遷移及分化，從而使受損血管的內皮在短時間內愈合，就可彌補PCI的不足，減少PCI術后再狹窄的發(fā)生。

4.1內皮祖細胞捕獲支架

內皮祖細胞捕獲支架是根據抗原抗體結合的原理，在支架表面包被CD34+抗體，支架植入血管后，循環(huán)中的EPC經過抗體包被的支架時，就會與支架上的CD34+抗體結合，隨后在支架表面分化成為成熟內皮細胞，形成完整的內皮細胞層，從而防止支架內再狹窄。這一新型支架目的是降低支架內再狹窄及血栓形成，降低PCI術后并發(fā)癥的發(fā)生，同時也可以避免長時間地使用抗血小板藥物治療帶來的副作用。

2002年，Kipshidze等［27］將包被有CD34+抗體的支架植入豬冠狀動脈內48 h后，包被CD34+抗體的支架表面完全覆蓋EPCs，并且在28 d時形成的新生內膜面積明顯高于普通支架，這證明了EPC捕獲支架在促進再內皮化的有效性。Aoki等［28］于2005年第1次將包被CD34抗體的支架植入患者體內，9個月后發(fā)現在參加實驗的16例患者中只有1例患者發(fā)生心腦血管事件，并且經皮冠狀動脈內超聲顯示支架再狹窄面積僅占支架的（27.2±21.6）%，這證明臨床應用內皮祖細胞捕獲支架是安全有效的。

4.2內皮祖細胞細胞移植的治療

Cheng等［29］證實EPCs移植通過PI3K-AKT通路增加鼠心肌梗死模型梗死部位的微血管生成，提高左心射血分數，改善心肌梗死預后。Wu等［24］將帶標記的EPC注入球囊損傷頸動脈內皮后的大鼠體內，結果在新生內膜中發(fā)現了熒光標記的EPC。且實驗組的新生內膜面積及內膜中膜面積比明顯低于對照組。由此可見，EPC移植可以快速修復受損內膜，減少新生內膜，減少PCI術后并發(fā)癥的發(fā)生，減少心血管不良事件的發(fā)生。

但是，成人外周血中的內皮祖細胞的數量非常少，即使在臍帶血中含量也不超過1%。研究發(fā)現，循環(huán)中內皮祖細胞少的患者更容易發(fā)生支架內再狹窄，而且發(fā)生支架內再狹窄的患者的內皮祖細胞黏附、增殖、分化能力更低，這對于藥物促進內皮祖細胞的動員、增殖、遷移和分化有很大的困難，而且對內皮祖細胞捕獲支架的效果也會有一定的影響。而目前，內皮祖細胞體外培養(yǎng)的技術日漸成熟，體外擴增培養(yǎng)內皮祖細胞大大增加內皮祖細胞的數量而且提高內皮祖細胞的純度，促進其分化，然后回輸人體，這樣就可以大大增加循環(huán)中的內皮祖細胞，進而加速再內皮化，預防PCI術后再狹窄的發(fā)生［30］。

5　結語

藥物洗脫支架的問世，給PCI的未來帶來了新的希望。但是如何實現PCI術后受損處血管的快速再內皮化，避免支架內再狹窄及晚期支架內血栓的形成等并發(fā)癥的發(fā)生，是PCI目前面臨的最重要問題。內皮祖細胞可以定向遷移至血管受損處增殖分化，促進血管再內皮化，從而在血管修復中有重要作用，與PCI術后并發(fā)癥的發(fā)生密切相關。然而，目前關于EPC仍然有很多問題沒有研究證實［30］。首先，目前仍沒有明確內皮祖細胞的精準標志，不僅EPC可以和CD34結合，平滑肌細胞、造血干細胞等都可以與其結合，這就給內皮祖細胞捕獲支架的研發(fā)帶來了很大挑戰(zhàn)。其次，EPC的動員、增殖、遷移、分化及歸巢，各個環(huán)節(jié)的機制還沒有完全明確。對于內皮祖細胞如何實現再內皮化的機制，仍有很大爭議。明確各個環(huán)節(jié)的機制，對于增加EPC的動員、遷移、黏附、增殖及分化有重要作用。其次，如何合成能與循環(huán)中的內皮祖細胞特異結合的物質并運用于臨床，還有待于分子技術的進一步發(fā)展及大量的臨床試驗。然而，隨著對內皮祖細胞的基礎研究進一步深入，臨床試驗的開展、新型的抗增生藥物和新型支架的積極研發(fā)等，我們可以相信以EPC為基礎的再內皮化治療未來可以預防PCI術后再狹窄及其一系列并發(fā)癥的發(fā)生。

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Reseaech peogeess on endothelial peogenitoe cells to deug-eluting in-stent eestenosis and ee-endothelialization

SUNWenbo1WANG He2SIChunying2XIE Jinhong2CHEN Yushan2CHAIShuangshuang2GUAN Huaimin2

1.The Graduate School，He'nan University of Chinese Medicine，He'nan Province，Zhengzhou 450000，China；2.Heart Center，the First Affiliated Hospital of He'nan University of Chinese Medicine，He'nan Province，Zhengzhou 450000，China

R541.4

A

1674-4721（2016）08（c）-0054-04

2016-04-25本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學基金面上項目（81273949）。

關懷敏（1957.2-），男，醫(yī)學博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)：心臟中心主任；研究方向：心血管疾病介入治療的基礎與臨床研究。