第二代高通量測(cè)序技術(shù)的原理及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

杜兵兵

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第二代高通量測(cè)序技術(shù)的原理及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

杜兵兵

【摘要】第二代高通量測(cè)序技術(shù)近年來取得了較快發(fā)展，與第一代測(cè)序技術(shù)相比具有速度快、準(zhǔn)確率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，主要包括454測(cè)序技術(shù)、Solexa測(cè)序技術(shù)以及SOLID測(cè)序技術(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究越來越廣泛，本文介紹了幾種高通量測(cè)序技術(shù)的作用原理以及它們?cè)谂R床方面的應(yīng)用情況。

【關(guān)鍵詞】高通量測(cè)序技術(shù)；454測(cè)序技術(shù)；Solexa測(cè)序技術(shù)；SOLID測(cè)序技術(shù)；臨床應(yīng)用

2005年Nature首次報(bào)道了454公司最新的基于微乳液PCR技術(shù)的高通量測(cè)序技術(shù)[1]，之后全球各個(gè)科研機(jī)構(gòu)和生物公司相繼開展高通量測(cè)序技術(shù)的研究工作。在這些競(jìng)爭(zhēng)中脫穎而出的有羅氏公司的454測(cè)序、Illumina公司的Solexa測(cè)序以及ABI公司的SOLID測(cè)序[2]，它們逐漸成為新一代高通量測(cè)序技術(shù)的代表者。這些測(cè)序技術(shù)已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，主要運(yùn)用于腫瘤、病原生物學(xué)等的預(yù)防、檢測(cè)及治療，成為臨床研究領(lǐng)域的重要技術(shù)手段。

1　第二代高通量測(cè)序的原理

1.1454高通量測(cè)序

454高通量測(cè)序是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)。根據(jù)樣品種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢NA文庫(kù)固定在相應(yīng)的捕獲磁珠上，形成油包水混合物，接著經(jīng)過乳液PCR擴(kuò)增形成單分子多拷貝的分子簇．隨后將乳液體系里釋放出來的磁珠放入VFP板的小孔進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序，對(duì)每個(gè)小孔中的DNA片段分子進(jìn)行準(zhǔn)確快速的堿基序列分析[3]。454測(cè)序成本較高，限制了該平臺(tái)的市場(chǎng)化普及。

1.2Solexa高通量測(cè)序

Solexa高通量測(cè)序采用的是邊合成邊測(cè)序，先根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將目標(biāo)DNA處理成小片段，接著將片段DNA回收并通過兩個(gè)接頭鏈接，這兩個(gè)接頭是通用的，之后將其處理成為單鏈狀態(tài)，這時(shí)就會(huì)與芯片表面的堿基進(jìn)行互補(bǔ)雜交固定在芯片上，另一端隨機(jī)與相鄰的另一個(gè)引物結(jié)合形成“橋”，反復(fù)上述過程30次左右則每個(gè)分子被放大1 000倍以上，成為單克隆的DNA簇，然后通過帶熒光標(biāo)記的 dNTP“可逆終止子”（3’端被一個(gè)疊氮基堵住）進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。用不同熒光標(biāo)記不同堿基則可以激發(fā)產(chǎn)生不同顏色的熒光，統(tǒng)計(jì)每一輪反應(yīng)結(jié)束后采集到的熒光信號(hào)，通過處理就可以知道原來模板DNA片段的序列[4]。該平臺(tái)成本低、性價(jià)比高，是主要的測(cè)序平臺(tái)。

1.3SOLID高通量測(cè)序

SOLID高通量測(cè)序技術(shù)以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，采用DNA連接酶實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序。該技術(shù)可以很大程度上降低錯(cuò)誤率。因?yàn)闇y(cè)序過程中應(yīng)用雙堿基編碼，即每個(gè)堿基被重復(fù)閱讀2次，這樣就使得SOLID系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%。該方法測(cè)序時(shí)儀器會(huì)自動(dòng)加入帶有熒光標(biāo)記的四種核苷酸探針，加入的探針與引物發(fā)生相應(yīng)的連接反應(yīng)，之后通過激發(fā)末端的熒光標(biāo)記，識(shí)別堿基類型完成測(cè)序。SOLID測(cè)序的特點(diǎn)是是高通量、高準(zhǔn)確度[5]。

2　第二代高通量測(cè)序在臨床上的應(yīng)用

2.1腫瘤研究方面

腫瘤是生物有機(jī)體受到致癌因素作用后，局部組織的某些細(xì)胞失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致異常增生而形成的病變。有機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)至2020年將有2 000萬新發(fā)癌癥病例，其中絕大部分將發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤學(xué)的前期研究、臨床診斷和治療恢復(fù)方面都具有重要作用，它為腫瘤研究提供了一種與基因芯片技術(shù)互補(bǔ)的新工具，可以進(jìn)行腫瘤基因組序列的再測(cè)序，從而達(dá)到對(duì)腫瘤基因組拷貝數(shù)、不同類別突破、基因相關(guān)性以及多態(tài)性的分析[6]。

2.2病原生物學(xué)檢測(cè)

病原微生物可以侵犯人體，引起感染甚至傳染病。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得病原體在檢測(cè)前不再需要進(jìn)行培養(yǎng)分群即可直接測(cè)序鑒別。2011年5月德國(guó)由于大腸桿菌感染引起3 000多人感染。當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)采用Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序系統(tǒng)對(duì)病原體進(jìn)行了緊急基因組測(cè)序分析，在不到10天時(shí)間內(nèi)即完成了測(cè)序工作，對(duì)病原體進(jìn)行了詳細(xì)的毒力、耐藥和遺傳進(jìn)化分析，最后發(fā)現(xiàn)該病原體是Shiga毒素E.coliO104:H4株[7]。

參考文獻(xiàn)

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[4]許波，張偉強(qiáng)，馮曉曦，等． 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在玉米中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]． 玉米科學(xué)，2014，22（1）：67-72．

[5]楊燁，劉娟． 第二代測(cè)序序列比對(duì)方法綜述[J]． 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，58（5）：463-470．

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[7]Rohde H，Qin J，Cui，et a1． Open-source genomic analysis of Shiga-toxin-producing E．coli O104：H4 [J]． N Engl J Med，2011，365（8）：718-724．

·論著·

The Working Principle of Second-generation High-throughput Sequencing Technology and its Application in Clinical Medicine

DU Bingbing, Luohe Medical College, Luohe 462002, China

[Abstract]The second-generation high-throughput sequencing technology has achieved rapid development in recent years. Compared with the first generation, the second-generation sequencing technology is with the advantages of faster, higher precision, and lower cost. The main technologies include 454 sequencing technology, Solexa sequencing technology and SOLID sequencing technology. High-throughput sequencing technology is more widely used in medical areas. This is a brief overview for the working principle of the second-generation highthroughput sequencing and its application in clinical medicine

[Key words]High-throughput sequencing, 454 sequencing technology, Solexa sequencing technology, SOLID sequencing technology, Clinical application

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．03．153

【文章編號(hào)】1674-9308（2016）03-0215-02

【中圖分類號(hào)】G642

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

作者單位：462002 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校