不同氮和磷培養(yǎng)條件下等鞭金藻的生長(zhǎng)、磷吸收和油脂品質(zhì)的分析

余世金， 胡 昊， 申曉菲， 曾建雄，①

(1. 安慶師范大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院， 安徽 安慶 246133； 2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 安徽 合肥 230026)

不同氮和磷培養(yǎng)條件下等鞭金藻的生長(zhǎng)、磷吸收和油脂品質(zhì)的分析

余世金1，2， 胡 昊2， 申曉菲2， 曾建雄2，①

(1. 安慶師范大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院， 安徽 安慶 246133； 2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 安徽 合肥 230026)

為探索不同水平N和P對(duì)等鞭金藻(IsochrysisgalbanaParke)產(chǎn)量及油脂品質(zhì)的影響，在富N(80.00 mg·L-1NO3--N)和無(wú)N(0.00 mg·L-1NO3--N)條件下設(shè)置富P、 限P和無(wú)P(20.00、0.25和0.00 mg·L-1PO43--P)共6組培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)10 d時(shí)等鞭金藻的藻體質(zhì)量濃度、P吸收量、總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脂肪酸產(chǎn)率變化、13個(gè)脂肪酸組分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及EPA和DHA的相對(duì)含量和產(chǎn)量進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示：在富N培養(yǎng)基中，等鞭金藻藻體質(zhì)量濃度的增幅明顯高于無(wú)N培養(yǎng)基且按培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度從高到低依次降低?？傮w上看，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)升高，且在富N培養(yǎng)基中總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于無(wú)N培養(yǎng)基；其中，富N限P和富N無(wú)P培養(yǎng)基中的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本上均高于富N富P培養(yǎng)基。富N培養(yǎng)基中各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大體上高于無(wú)N培養(yǎng)基，且限P培養(yǎng)基中各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大體上高于富P和無(wú)P培養(yǎng)基。在富N富P培養(yǎng)基中1 L藻體的P吸收量最高(0.014 8 mg)，并且吸收的P絕大部分被貯存在藻體中，而在無(wú)N富P培養(yǎng)基中P吸收量明顯降低(0.009 8 mg)。在富N富P培養(yǎng)基中，飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對(duì)含量及EPA相對(duì)含量和產(chǎn)量均最低，但DHA相對(duì)含量和產(chǎn)量則最高。在富N限P培養(yǎng)基中，等鞭金藻的EPA產(chǎn)量和脂肪酸產(chǎn)率均最高，其DHA產(chǎn)量也較高；5種優(yōu)質(zhì)脂肪酸組分(即C18∶1n9c、C16∶0、C14∶0、C18∶0和C16∶1n9)的總相對(duì)含量達(dá)到65.86%，尤其是C18∶1n9c，其相對(duì)含量高達(dá)28.19%。綜合分析結(jié)果顯示：富N培養(yǎng)基有利于等鞭金藻的生長(zhǎng)、P吸收及脂肪酸積累，其中，富N限P培養(yǎng)基是等鞭金藻高產(chǎn)且產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油脂的適宜培養(yǎng)基。此外，等鞭金藻不但是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)質(zhì)資源而且是生產(chǎn)DHA和清除廢水中P的潛在生物資源。

等鞭金藻; 氮和磷水平; 微藻生長(zhǎng); 磷吸收; 油脂產(chǎn)量; 脂肪酸組分

生物油脂經(jīng)過甲基化可轉(zhuǎn)變成多種生物燃料[1]，為世界公認(rèn)的可再生能源。微藻廣泛分布于陸地和海洋，部分微藻種類的油脂含量較高，是生產(chǎn)第三代生物柴油的資源之一[2]。為了提高生物柴油的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本，應(yīng)盡快篩選出油脂含量高的藻株并探索出提高微藻生物量和油脂含量的培養(yǎng)方法。

相關(guān)研究結(jié)果表明：在高溫、強(qiáng)光、高鹽、低氮(N)或低磷(P)條件下，微藻的油脂含量升高，但其生物量卻明顯下降，致使其產(chǎn)油率增幅不大甚至下降[3-6]。Chu等[7-8]的研究結(jié)果表明：在無(wú)N富P條件下培養(yǎng)14 d，小球藻(ChlorellavulgarisBeij.)的日均產(chǎn)油率是富N富P條件下的1.35倍；在無(wú)N富P條件下培養(yǎng)16 d，斜生柵藻(ScenedesmusobliquusKütz.)的日均產(chǎn)油率約是富N富P條件下的2.00倍，并據(jù)此認(rèn)為“N缺乏-P充足”是這2種微藻油脂合成的真正“觸發(fā)器”，與Khozin-Golberg等[9]的觀點(diǎn)“N缺乏是微藻油脂合成的觸發(fā)器”明顯不同。此外，Chu等[7]的研究結(jié)果顯示，無(wú)N富P條件下小球藻的日均P吸收量是富N富P條件下的3.82倍。采用富營(yíng)養(yǎng)化水體培育小球藻，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)提高其產(chǎn)油率和去除廢水中P的雙重目的，對(duì)小球藻的資源開發(fā)和水體P污染修復(fù)均具有重要意義。然而，盡管目前已知小球藻的這些特性，但由于微藻種類眾多，有關(guān)其他微藻種類對(duì)環(huán)境P的作用尚未明確。

等鞭金藻(IsochrysisgalbanaParke)隸屬金藻門(Chrysophyta)，油脂含量高達(dá)22%～42%[10-11]，是生產(chǎn)生物柴油的備選藻種[12]。微藻油脂中的C20∶5n3(EPA)和C22∶6n3(DHA)對(duì)人類心血管疾病和大腦發(fā)育等具有重要作用[13-14]，在保健、醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域越來越受到關(guān)注[9,15]；等鞭金藻的EPA和DHA含量較高，已被作為生產(chǎn)EPA和DHA的備選藻種[16-17]。

鑒于此，作者設(shè)置富N和無(wú)N及不同P水平的培養(yǎng)條件，分析等鞭金藻的藻體質(zhì)量濃度變化，并對(duì)培養(yǎng)基中的P質(zhì)量濃度及主要脂肪酸組成和含量的變化進(jìn)行比較研究，探明富N和無(wú)N條件下不同P水平對(duì)等鞭金藻產(chǎn)油狀況的影響，以期篩選出適宜于等鞭金藻的培養(yǎng)條件，并為優(yōu)質(zhì)生物柴油資源的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及培養(yǎng)條件

供試等鞭金藻購(gòu)自上海光語(yǔ)科技發(fā)展有限公司?；A(chǔ)培養(yǎng)基為用人工海水配制的f/2培養(yǎng)基[18]，其中，NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3·9H2O和微量元素母液均需在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后置于4 ℃冰箱中保存、備用；人工海水在使用前需在121 ℃條件下滅菌20 min；維生素母液經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜過濾后置于4 ℃冰箱中保存、備用。

用橡膠塞密封的2 L三角燒瓶(橡膠塞打孔并插入2根玻璃管以通氣)進(jìn)行藻體培養(yǎng)，每瓶裝入1 900 mL液體培養(yǎng)基， 培養(yǎng)時(shí)輸入混合氣體 〔V(空氣)∶V(CO2)=50∶1〕，輸氣量為500 mL·min-1，氣體經(jīng)孔徑0.22 μm的聚四氟乙烯濾頭過濾；以功率40 W的飛利浦日光燈組作為光源，三角燒瓶距離燈管20 cm，光照度3 000～3 300 lx，光照時(shí)間14 h·d-1，培養(yǎng)溫度(20±1) ℃，培養(yǎng)基pH 6.2～pH 6.8。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 共設(shè)置6組培養(yǎng)基：富N富P(T1)、富N限P(T2)、富N無(wú)P(T3)、無(wú)N富P(T4)、無(wú)N限P(T5)、無(wú)N無(wú)P(T6)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置富N為80.00 mg·L-1NO3--N、無(wú)N為0.00 mg·L-1NO3--N；富P為20.00 mg·L-1PO43--P、限P為0.25 mg·L-1PO43--P、無(wú)P為0.00 mg·L-1PO43--P。每個(gè)處理組均設(shè)置3次重復(fù)。由于本實(shí)驗(yàn)只對(duì)富N和無(wú)N條件下不同P水平等鞭金藻的產(chǎn)油狀況進(jìn)行比較，因此未設(shè)置對(duì)照。

1.2.2 接種及取樣方法 接種體為在完全培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞，將藻液在20 ℃條件下5 000 r·min-1離心6 min，藻泥用人工海水清洗1次后于上述條件下再離心1次；每升培養(yǎng)液中接種干質(zhì)量為85 mg的藻體。

供試等鞭金藻共培養(yǎng)10 d，在每日相同時(shí)間取樣并測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。其中，藻體質(zhì)量濃度和P吸收量每天測(cè)定1次，共取樣測(cè)定10次；每隔1 d取樣制備藻粉用于脂肪酸測(cè)定，各處理組均取樣測(cè)定5次。

1.2.3 藻體質(zhì)量濃度測(cè)定 采用“差重法”測(cè)定藻體質(zhì)量濃度。將孔徑0.45 μm的乙酸纖維素濾膜置于105 ℃烘干至恒質(zhì)量，記為m0；取10 mL藻液，用真空過濾器過濾并于105 ℃烘干至恒質(zhì)量，記為m1，根據(jù)公式“ρ=(m1-m0)/0.01”計(jì)算藻體的質(zhì)量濃度(ρ)。每處理各重復(fù)均測(cè)定3個(gè)平行樣品，結(jié)果取平均值。

1.2.4 P吸收量測(cè)定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別取富P組(富N富P組和無(wú)N富P組)藻液約5 mL、限P組(富N限P組和無(wú)N限P組)藻液約30 mL，用孔徑0.22 μm的無(wú)機(jī)濾頭進(jìn)行過濾以去除藻細(xì)胞，保留濾液。分別取富P組濾液各200 μL，用去離子水定容至25 mL；限P組濾液則直接用去離子水定容至25 mL；以去離子水作為空白對(duì)照，采用鉬銻抗分光光度法[19]測(cè)定培養(yǎng)基中的P質(zhì)量濃度，每個(gè)處理組重復(fù)測(cè)定2次。按照公式“ρP=ρPt-ρP(t+1)”計(jì)算每日培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度的降幅(ρP)，式中，ρP為培養(yǎng)基中的P質(zhì)量濃度；t為培養(yǎng)時(shí)間。并且，按照公式“mP=ρP/ρ”計(jì)算1 L藻體的P吸收量(mP)。

1.2.5 脂肪酸組成及含量分析 參照Rodríguez-Ruiz等[20]的方法完成藻體的脂肪酸提取及甲基化過程。 稱取約20 mg冷凍的干藻粉， 加入轉(zhuǎn)甲基試劑 〔V(甲醇)∶V(乙酰氯)=9∶1〕，置于80 ℃恒溫水浴反應(yīng)2.5 h，冷卻并加入0.1 mol·L-1NaCl溶液1 mL，再加入含0.5 g·L-1苯甲酸甲酯(內(nèi)標(biāo))的正己烷2 mL，充分混勻后于3 000 r·min-1離心3 min，將上清液移到安捷倫氣相小瓶中用于氣相色譜分析。

用Agilent 6890N氣相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：使用氫火焰離子化檢測(cè)器，色譜柱為Supelco DB-FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；采取程序升溫，于140 ℃保溫2 min，再以10 ℃·min-1的速率升溫至 240 ℃并保持2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃；載氣為高純氮?dú)猓魉?5 mL·min-1；氫氣流速40 mL·min-1，空氣流速450 mL·min-1，分流比1∶10；進(jìn)樣量1 μL。

通過與苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比鑒別各脂肪酸組分，利用各脂肪酸組分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比、內(nèi)標(biāo)量、標(biāo)線方程和藻粉質(zhì)量計(jì)算各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算公式為：脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)=〔(標(biāo)線系數(shù)×峰面積比×內(nèi)標(biāo)量)/藻粉質(zhì)量〕×100%，式中，峰面積比為待定脂肪酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。脂肪酸產(chǎn)率為每天1 L藻液生產(chǎn)的脂肪酸量， 計(jì)算公式為： 脂肪酸產(chǎn)率=〔(培養(yǎng)結(jié)束時(shí)藻體質(zhì)量濃度×培養(yǎng)結(jié)束時(shí)藻體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù))-(接種藻體質(zhì)量濃度×接種藻體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù))〕/培養(yǎng)時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用EXCEL 2010和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中等鞭金藻藻體質(zhì)量濃度的變化

檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明：在不同質(zhì)量濃度N和P的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，富N培養(yǎng)基中等鞭金藻藻體的質(zhì)量濃度增幅明顯高于無(wú)N培養(yǎng)基；其中，在富N富P(80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P)、富N限P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)和富N無(wú)P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中藻體的質(zhì)量濃度分別較培養(yǎng)初期增加740、 655和415 mg·L-1， 而無(wú)N富P (0.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P)、無(wú)N限P(0.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)和無(wú)N無(wú)P(0.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中藻體的質(zhì)量濃度分別較培養(yǎng)初期增加185、190和180 mg·L-1。

由圖1還可以看出：富N條件下，等鞭金藻的藻體質(zhì)量濃度按培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度從高到低依次降低，即富N富P、富N限P、富N無(wú)P培養(yǎng)基的藻體質(zhì)量濃度依次降低；而在無(wú)N培養(yǎng)基中不論P(yáng)質(zhì)量濃度如何變化藻體的質(zhì)量濃度幾乎無(wú)差異。

—■—: 富N富P培養(yǎng)基 N rich-P rich medium (80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P); —▲—: 富N限P培養(yǎng)基 N rich-P limited medium (80.00 mg·L-1NO3--N + 0.25 mg·L-1PO43--P); —●—: 富N無(wú)P培養(yǎng)基 N rich-P free medium (80.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P); —□—: 無(wú)N富P培養(yǎng)基 N free-P rich medium (0.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P); —△—: 無(wú)N限P培養(yǎng)基 N free-P limited medium (0.00 mg·L-1NO3--N + 0.25 mg·L-1PO43--P); —○—: 無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基 N free-P free medium (0.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P).

圖1 不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中等鞭金藻藻體質(zhì)量濃度的變化

Fig. 1 Change in algae mass concentration ofIsochrysisgalbanaParke in media with different mass concentrations of N and P

2.2 富P和限P培養(yǎng)基中等鞭金藻P吸收量的變化

檢測(cè)結(jié)果表明： 接種第1天， 富N限P (80.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)和無(wú)N限P(0.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度已低于檢出限，說明培養(yǎng)基中的P已經(jīng)全部被等鞭金藻吸收。然而，在富N富P(80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P)和無(wú)N富P(0.00 mg·L-1NO3--N+20 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度降幅的變化趨勢(shì)見圖2。由圖2可以看出：富N富P和無(wú)N富P培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度的降幅持續(xù)增大，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)富N富P和無(wú)N富P培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度的降幅分別為12.20和2.65 mg·L-1， 并且前者極顯著高于后者(P= 0.000 5)。根據(jù)上述藻體質(zhì)量濃度計(jì)算出富N富P和無(wú)N富P培養(yǎng)基中1 L藻體的干質(zhì)量分別為825和270 mg，據(jù)此計(jì)算出這2組培養(yǎng)基中1 L藻體的P吸收量分別為0.014 8和0.009 8 mg，且后者為前者的66.2%，可見無(wú)N條件下等鞭金藻對(duì)P的吸收能力明顯下降。

—■—: 富N富P培養(yǎng)基 N rich-P rich medium (80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P); —□—: 無(wú)N富P培養(yǎng)基 N free-P rich medium (0.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P).

圖2 等鞭金藻培養(yǎng)期間富N富P和無(wú)N富P培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度降幅的變化

Fig. 2 Change in descent range of P mass concentration in N rich-P rich and N free-P rich media during cultivation period ofIsochrysisgalbanaParke

2.3 在不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中等鞭金藻脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化及其組成和產(chǎn)率的比較

2.3.1 總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明：在不同質(zhì)量濃度N和P的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，除富N富P(80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基外，其余5組培養(yǎng)基中等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈持續(xù)升高的趨勢(shì)；并且，培養(yǎng)6 d內(nèi)，富N培養(yǎng)基中等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于無(wú)N培養(yǎng)基；培養(yǎng)6～10 d，富N限P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)和富N無(wú)P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍持續(xù)高于無(wú)N培養(yǎng)基，但富N富P培養(yǎng)基中等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻降至無(wú)N培養(yǎng)基水平。

—■—: 富N富P培養(yǎng)基 N rich-P rich medium (80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P); —▲—: 富N限P培養(yǎng)基 N rich-P limited medium (80.00 mg·L-1NO3--N + 0.25 mg·L-1PO43--P); —●—: 富N無(wú)P培養(yǎng)基 N rich-P free medium (80.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P); —□—:無(wú)N富P培養(yǎng)基 N free-P rich medium (0.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P); —△—: 無(wú)N限P培養(yǎng)基 N free-P limited medium (0.00 mg·L-1NO3--N + 0.25 mg·L-1PO43--P); —○—: 無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基 N free-P free medium (0.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P).

圖3 不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中等鞭金藻總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

Fig. 3 Change in mass fraction of total fatty acids ofIsochrysisgalbanaParke in media with different mass concentrations of N and P

由圖3還可以看出：在培養(yǎng)期內(nèi)，在3組富N培養(yǎng)基中，限P和無(wú)P培養(yǎng)基中等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體上明顯高于富P培養(yǎng)基，且以無(wú)P培養(yǎng)基為最高，各組培養(yǎng)基間差異較大；在3組無(wú)N培養(yǎng)基中，其總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在限P培養(yǎng)基中最高、在無(wú)P培養(yǎng)基中最低，但在各組培養(yǎng)基間差異不明顯。

2.3.2 脂肪酸組成及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較 檢測(cè)結(jié)果(表1)表明：在不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，不同處理組等鞭金藻藻體中13種常見脂肪酸(包括10種常見生物柴油脂肪酸和3種多不飽和脂肪酸)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在明顯差異；除C20∶0、C18∶3n3、C18∶4n3外，各處理組等鞭金藻藻體中其他10種脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本上均高于接種體?？傮w來看，在限P培養(yǎng)基中各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于富P和無(wú)P培養(yǎng)基，且在富N培養(yǎng)基中各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大體上高于無(wú)N培養(yǎng)基。

由表1還可以看出：培養(yǎng)10 d時(shí)，除富N富P培養(yǎng)基外，其余5組培養(yǎng)基中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的前3個(gè)脂肪酸組分均依次為C18∶1n9c、C16∶0、C14∶0，三者的總相對(duì)含量在富N限P培養(yǎng)基中最低(61.15%)、在富N無(wú)P培養(yǎng)基中最高(70.23%)， 在無(wú)N富P、 無(wú)N限P和無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基中差異極小，分別為65.30%、 65.41%和65.24%。 限P條件下， 無(wú)N培養(yǎng)基中C18∶1n9c、C16∶0和C14∶0的總相對(duì)含量較富N培養(yǎng)基提高6.97%；而在無(wú)P條件下，無(wú)N培養(yǎng)基中三者的總相對(duì)含量則較富N培養(yǎng)基降低7.09%。

表1 在不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d等鞭金藻各脂肪酸組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較
Table 1 Comparison on mass fraction of different fatty acid compositions of Isochrysis galbana Parke cultured for 10 d in media with different mass concentrations of N and P

處理2)Treatment2)各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% MassfractionofeachfattyacidcompositionC14∶0C16∶0C18∶0C20∶0C16∶1n9C18∶1n9cC18∶2n6c T12.921±0.060b1.621±0.056d0.072±0.018cd0.000±0.000c1.139±0.018a2.313±0.064d3.543±0.103a T24.062±0.015a4.482±0.042b0.437±0.014a0.058±0.001b0.779±0.047b7.307±0.044b1.745±0.040b T34.390±0.193a5.945±0.062a0.487±0.026a0.067±0.000b0.597±0.000c9.229±0.099a1.670±0.018b T42.358±0.092b3.518±0.099c0.201±0.004b0.047±0.003b0.375±0.014d5.478±0.190c0.780±0.027c T52.560±0.073b3.971±0.080bc0.238±0.007b0.051±0.001b0.414±0.005d5.937±0.163c0.881±0.083c T62.330±0.023b3.574±0.067c0.212±0.011b0.045±0.001b0.366±0.003d5.276±0.171c0.774±0.027c I2.175±0.042b1.807±0.035d0.103±0.005c0.173±0.010a0.526±0.022cd2.022±0.013d0.917±0.010c

處理2)Treatment2)各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% MassfractionofeachfattyacidcompositionC18∶3n3C18∶4n3C20∶1n9C20∶5n3C22∶1n9C22∶6n3 T11.812±0.117a1.709±0.113c0.156±0.003ab0.142±0.021c0.000±0.000c2.119±0.090a T21.439±0.073a2.800±0.134a0.189±0.009a0.335±0.007a0.036±0.051b2.247±0.089a T30.916±0.004b2.284±0.051b0.135±0.006b0.383±0.001a0.088±0.002a1.666±0.019b T40.764±0.036b1.762±0.132c0.060±0.001c0.297±0.012b0.082±0.002a1.665±0.163b T50.813±0.009b1.892±0.039c0.065±0.003c0.330±0.006ab0.085±0.002a1.824±0.042b T60.697±0.029b1.670±0.035c0.058±0.005c0.285±0.012b0.075±0.002ab1.775±0.052b I1.178±0.075ab2.836±0.102a0.125±0.002b0.175±0.001c0.000±0.000c1.666±0.073b

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)T1: 富N富P培養(yǎng)基 N rich-P rich medium (80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P); T2: 富N限P培養(yǎng)基 N rich-P limited medium (80.00 mg·L-1NO3--N + 0.25 mg·L-1PO43--P); T3: 無(wú)N限P培養(yǎng)基 N rich-P free medium (80.00 mg·L-1NO3--N + 0.00 mg·L-1PO43--P); T4: 無(wú)N富P培養(yǎng)基 N free-P rich medium (0.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P); T5: 無(wú)N限P培養(yǎng)基 N free-P limited medium (0.00 mg·L-1NO3--N + 0.25 mg·L-1PO43--P); T6: 無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基 N free-P free medium (0.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P); I: 接種體Inoculum.

2.3.3 不同類型脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較 檢測(cè)結(jié)果(表2)表明：在不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，各處理組等鞭金藻藻體的總飽和脂肪酸、總不飽和脂肪酸和總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總飽和脂肪酸的相對(duì)含量大多顯著高于接種體；在3組富N培養(yǎng)基中，這4項(xiàng)指標(biāo)在富P、限P和無(wú)P培養(yǎng)基中依次遞增；而在3組無(wú)N培養(yǎng)基中，這4項(xiàng)指標(biāo)則在限P培養(yǎng)基中最高、在富P和無(wú)P培養(yǎng)基中相對(duì)較低，且各處理組間無(wú)顯著差異。其中，在富N富P、富N限P和富N無(wú)P培養(yǎng)基中，等鞭金藻藻體的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較無(wú)N富P、無(wú)N限P和無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基升高〗0.92%、35.96%和62.55%?？傮w上看，在富P條件下富N與無(wú)N培養(yǎng)基間上述4項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯差異，而在限P和無(wú)P條件下富N與無(wú)N培養(yǎng)基間上述4項(xiàng)指標(biāo)差異明顯。

表2 在不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d等鞭金藻不同類型脂肪酸含量的比較
Table 2 Comparison on content of different types of fatty acids of Isochrysis galbana Parke cultured for 10 d in media with different mass concentrations of N and P

處理2)Treatment2)質(zhì)量濃度/mg·L-1 MassconcentrationNO3--NPO43--PSFA/%UFA/%TFA/%RSFA/% T180.0020.004.614±0.134c12.933±0.395b17.547±0.529b26.306±0.320d T280.000.259.039±0.072a16.877±0.479a25.916±0.407a34.878±0.076b T380.000.0010.889±0.281a16.968±0.109a27.857±0.391a39.089±0.707a T40.0020.006.124±0.198b11.263±0.577bc17.387±0.775b35.222±0.165b T50.000.256.820±0.161b12.241±0.276b19.061±0.437b35.780±0.122b T60.000.006.161±0.102b10.976±0.336c17.137±0.437b35.951±0.091b I4.285±0.122c9.445±0.210c13.703±0.362c31.271±0.263c

1)SFA: 總飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Mass fraction of total saturated fatty acids; UFA: 總不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù) Mass fraction of total unsaturated fatty acids; TFA: 總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù) Mass fraction of total fatty acids; RSFA: 總飽和脂肪酸的相對(duì)含量 Relative content of total saturated fatty acids. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)T1： 富N富P培養(yǎng)基 N rich-P rich medium； T2： 富N限P培養(yǎng)基 N rich-P limited medium； T3： 富N無(wú)P培養(yǎng)基 N rich-P free medium； T4： 無(wú)N富P培養(yǎng)基 N free-P rich medium； T5： 無(wú)N限P培養(yǎng)基 N free-P limited medium； T6： 無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基 N free-P free medium； I： 接種體Inoculum.

由表2還可以看出：培養(yǎng)10 d時(shí)，各處理組等鞭金藻的總飽和脂肪酸相對(duì)含量(RSFA)為26.30%～39.09%。在3組富N培養(yǎng)基中，富P、限P和無(wú)P培養(yǎng)基間藻體的RSFA值差異較大， 分別為26.30%、 34.88%和39.09%，表明富N條件下限P和無(wú)P培養(yǎng)基可使等鞭金藻藻體的RSFA值顯著提高，且以無(wú)P培養(yǎng)基中藻體的RSFA值為最高。在3組無(wú)N培養(yǎng)基中，富P、限P和無(wú)P培養(yǎng)基中藻體的RSFA值差異很小，分別為35.22%、35.78%和35.95%。在富P和限P培養(yǎng)基中，無(wú)N培養(yǎng)基中藻體的RSFA值分別較富N培養(yǎng)基提高33.92%和2.58%；而在無(wú)P培養(yǎng)基中，無(wú)N培養(yǎng)基中藻體的RSFA值則較富N培養(yǎng)基降低8.03%。

2.3.4 脂肪酸產(chǎn)率變化的比較 檢測(cè)結(jié)果(表3)表明：在不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，在富N富P和富N限P培養(yǎng)基中等鞭金藻的脂肪酸產(chǎn)率均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，并均在培養(yǎng)4 d時(shí)達(dá)到最高，而在另4組培養(yǎng)基中則總體上呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢(shì)。其脂肪酸產(chǎn)率在富N培養(yǎng)基中顯著高于無(wú)N培養(yǎng)基，且在培養(yǎng)4 d時(shí)以富N限P培養(yǎng)基中脂肪酸產(chǎn)率為最高，達(dá)到21.15 mg·L-1·d-1?？傮w來看，富N和無(wú)N條件下，限P培養(yǎng)基中等鞭金藻脂肪酸產(chǎn)率高于富P和無(wú)P培養(yǎng)基，但無(wú)N條件下限P培養(yǎng)基中脂肪酸產(chǎn)率與富P和無(wú)P培養(yǎng)基無(wú)顯著差異。

2.4 不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中等鞭金藻EPA和DHA相對(duì)含量和產(chǎn)量的比較

在不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，等鞭金藻中EPA(C20∶5n3)和DHA(C22∶6n3)的相對(duì)含量和產(chǎn)量見表4。由表4可以看出： 在無(wú)N富P(0.00mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P)、無(wú)N限P(0.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)和無(wú)N無(wú)P(0.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中等鞭金藻的EPA相對(duì)含量均顯著高于富N富P (80.00 mg·L-1NO3--N + 20.00 mg·L-1PO43--P)、富N限P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)和富N無(wú)P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基；而在前3組培養(yǎng)基中，等鞭金藻的DHA相對(duì)含量高于富N限P和富N無(wú)P培養(yǎng)基，但低于富N富P培養(yǎng)基。富N條件下，等鞭金藻的EPA相對(duì)含量在富P、限P和無(wú)P培養(yǎng)基中依次遞增，且在后2組培養(yǎng)基間無(wú)顯著差異；而其DHA的相對(duì)含量則依次遞減，且各組間無(wú)顯著差異。在無(wú)N條件下，等鞭金藻的EPA相對(duì)含量在限P培養(yǎng)基中最高、在無(wú)P培養(yǎng)基中最低；而其DHA的相對(duì)含量則在無(wú)P培養(yǎng)基中最高、在限P培養(yǎng)基中最低。

表3 不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中等鞭金藻脂肪酸產(chǎn)率的變化
Table 3 Change in productivity of fatty acids of Isochrysis galbana Parke in media with different mass concentrations of N and P

處理2)Treatment2)質(zhì)量濃度/mg·L-1MassconcentrationNO3--NPO43--P不同培養(yǎng)時(shí)間的脂肪酸產(chǎn)率/mg·L-1·d-1 Productivityoffattyacidsatdifferentculturetimes2d4d6d8d10d T180.0020.0018.79±0.87a19.73±0.08a19.54±0.29a14.44±1.18b13.11±0.76b T280.000.2519.71±1.35a21.15±0.60a18.72±0.44a18.57±0.27a17.81±1.00a T380.000.0017.14±1.34a16.91±0.76b15.90±0.09b14.15±0.71b12.56±0.53b T40.0020.006.28±0.32b5.10±0.34c4.83±0.03c4.24±0.24c3.32±0.14c T50.000.256.98±0.30b5.44±0.52c5.00±0.10c4.55±0.28c3.88±0.22c T60.000.006.62±0.72b4.52±0.45c4.64±0.60c3.78±0.42c3.17±0.21c

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)T1： 富N富P培養(yǎng)基 N rich-P rich medium； T2： 富N限P培養(yǎng)基 N rich-P limited medium； T3： 富N無(wú)P培養(yǎng)基 N rich-P free medium； T4： 無(wú)N富P培養(yǎng)基 N free-P rich medium； T5： 無(wú)N限P培養(yǎng)基 N free-P limited medium； T6： 無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基 N free-P free medium.

表4 不同質(zhì)量濃度N和P培養(yǎng)基中等鞭金藻EPA和DHA相對(duì)含量及產(chǎn)量的比較
Table 4 Comparison on relative content and yield of EPA and DHA in Isochrysis galbana Parke in media with different mass concentrations of N and P

處理2)Treatment2)質(zhì)量濃度/mg·L-1MassconcentrationNO3--NPO43--P相對(duì)含量/% RelativecontentEPADHA產(chǎn)量/mg YieldEPADHA T180.0020.000.809±0.021c12.076±0.090a1.049±0.158c15.681±0.663a T280.000.251.293±0.007b8.670±0.089b2.192±0.046a14.718±0.582a T380.000.001.375±0.001b5.981±0.019c1.591±0.004b6.913±0.081b T40.0020.001.708±0.012a9.576±0.163b0.550±0.022d3.081±0.301c T50.000.251.731±0.006a9.569±0.042b0.627±0.011d3.466±0.080c T60.000.001.663±0.012a10.358±0.052ab0.574±0.022d3.195±0.094c

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)T1： 富N富P培養(yǎng)基 N rich-P rich medium； T2： 富N限P培養(yǎng)基 N rich-P limited medium； T3： 富N無(wú)P培養(yǎng)基 N rich-P free medium； T4： 無(wú)N富P培養(yǎng)基 N free-P rich medium； T5： 無(wú)N限P培養(yǎng)基 N free-P limited medium； T6： 無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基 N free-P free medium.

由表4還可見：在無(wú)N培養(yǎng)基中，等鞭金藻的EPA和DHA產(chǎn)量顯著低于富N培養(yǎng)基。在富N條件下，其EPA產(chǎn)量在限P培養(yǎng)基中最高、在富P培養(yǎng)基中最低，且在各培養(yǎng)基間差異顯著；而其DHA產(chǎn)量則在富P培養(yǎng)基中最高、在無(wú)P培養(yǎng)基中最低，且在無(wú)P培養(yǎng)基中與富P和限P培養(yǎng)基間有顯著差異。無(wú)N條件下，二者的產(chǎn)量均在限P培養(yǎng)基中最高、在富P培養(yǎng)基中最低，且在各培養(yǎng)基間無(wú)顯著差異。

3 討論和結(jié)論

3.1 等鞭金藻生長(zhǎng)量與培養(yǎng)基中N和P濃度的關(guān)系

相關(guān)研究結(jié)果表明：在缺N條件下微藻的生物量甚少增加[21-22]；Qian等[23]的研究結(jié)果表明：缺N條件下，三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)的細(xì)胞分裂停止，細(xì)胞密度增加甚微；本研究中，在缺N培養(yǎng)基中等鞭金藻藻體的質(zhì)量濃度僅略有提高，說明N對(duì)微藻的生長(zhǎng)具有重要作用。磷酸鹽是微藻細(xì)胞內(nèi)磷脂及核酸等物質(zhì)合成的必需原料[24]，同時(shí)在微藻ATP和NADP的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[25]，可見，P是微藻細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的必需營(yíng)養(yǎng)元素，在其他環(huán)境條件正常時(shí)，P缺乏必然會(huì)影響微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖。本研究中，等鞭金藻藻體的質(zhì)量濃度在富N富P(80.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中最高、在富N限P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中居中、在富N無(wú)P (80.00 mg·L-1NO3--N + 0.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中最低，說明富N條件下等鞭金藻的生長(zhǎng)和繁殖隨培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度降低而下降；在無(wú)N富P(0.00 mg·L-1NO3--N+20.00 mg·L-1PO43--P)、無(wú)N限P(0.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)和無(wú)N無(wú)P(0.00 mg·L-1NO3--N+0.00 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基中等鞭金藻藻體的質(zhì)量濃度差異很小，說明N嚴(yán)重缺乏時(shí)，P濃度對(duì)等鞭金藻生長(zhǎng)和繁殖的影響減弱。

3.2 等鞭金藻對(duì)P的吸收和貯存能力分析

研究結(jié)果表明：無(wú)N富P條件下小球藻單位藻體質(zhì)量的P吸收量為富N富P條件下的3.95倍[7]；而無(wú)N富P條件下斜生柵藻單位藻體質(zhì)量的P吸收量則為富N富P條件下的1.33倍[8]。然而，等鞭金藻在富N富P和無(wú)N富P條件下的P吸收量變化與小球藻和斜生柵藻并不一致，表現(xiàn)為在無(wú)N富P培養(yǎng)基中低于富N富P培養(yǎng)基。說明在無(wú)N富P條件下不同藻種的P吸收能力差異較大。

不同藻種對(duì)P需求量的差別也很大[26]。等鞭金藻的比生長(zhǎng)速率在P含量高于常規(guī)f/2培養(yǎng)基1/4以上的f/2培養(yǎng)基中無(wú)明顯變化[27]，說明常規(guī)f/2培養(yǎng)基中近3/4的P對(duì)于等鞭金藻的生長(zhǎng)和繁殖是多余的；而且等鞭金藻細(xì)胞中的P貯存量是其正常生長(zhǎng)需求量的6倍。本研究中，富N限P培養(yǎng)基的P質(zhì)量濃度為0.25 mg·L-1，略高于常規(guī)f/2培養(yǎng)基P濃度的1/4，從藻體質(zhì)量濃度的增長(zhǎng)情況看，該培養(yǎng)基與富N富P培養(yǎng)基中等鞭金藻藻體的質(zhì)量濃度在培養(yǎng)前5 d基本一致，培養(yǎng)5 d后開始逐漸低于富N富P培養(yǎng)基，但2組培養(yǎng)基間無(wú)明顯差異，說明0.25 mg·L-1P基本可以滿足等鞭金藻生長(zhǎng)過程中對(duì)P的需求。然而，培養(yǎng)10 d時(shí)富N富P培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度的降幅高達(dá)12.20 mg·L-1，據(jù)此推測(cè)培養(yǎng)基中的P少部分用于等鞭金藻生長(zhǎng)，絕大部分被貯存在藻體內(nèi)，據(jù)此可將等鞭金藻用于含P廢水的生物處理。

3.3 等鞭金藻的脂肪酸生產(chǎn)與培養(yǎng)基中N和P濃度的關(guān)系

通常情況下，在缺N條件下，微藻的總脂肪酸含量增加[28]；而Fidalgo等[29]的研究結(jié)果卻表明等鞭金藻可在N豐富的條件下積累脂肪酸。本研究中，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間(培養(yǎng)10 d)，在富N限P和富N無(wú)P培養(yǎng)基中等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于無(wú)N培養(yǎng)基，說明無(wú)N條件下等鞭金藻的脂肪酸含量并沒有提高。在富N富P培養(yǎng)基中等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為在培養(yǎng)1～6 d高于無(wú)N培養(yǎng)基，但在培養(yǎng)6～10 d卻低于無(wú)N培養(yǎng)基，這是否與藻體內(nèi)積累的大量P有關(guān)，尚待深入研究。

相關(guān)研究表明：缺P對(duì)微藻總脂肪酸含量的影響與藻種和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。缺P能夠促進(jìn)單胞藻(MonodussubterraneusJ. B. Petersen)和三角褐指藻等藻類脂肪酸含量提高[30]，卻使小綠球藻(NannochlorisatomusButcher)和融合微藻(Tetraselmissp.)等藻類脂肪酸含量降低[31]；Chu等[7]認(rèn)為，無(wú)N條件下缺P可使小球藻中脂肪酸含量提高，而在富N條件下缺P卻無(wú)這一作用。本研究中，富N條件下等鞭金藻的總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在無(wú)P培養(yǎng)基中最高、在限P培養(yǎng)基中居中、在富P培養(yǎng)基中最低；無(wú)N條件下，則表現(xiàn)為在限P培養(yǎng)基中略高，但與富P和無(wú)P培養(yǎng)基無(wú)明顯差異，說明富N條件下缺P可以促進(jìn)等鞭金藻藻體內(nèi)脂肪酸的合成，而無(wú)N條件下P濃度對(duì)等鞭金藻藻體內(nèi)脂肪酸合成的影響卻很小。

脂肪酸產(chǎn)率是衡量微藻產(chǎn)油能力的重要指標(biāo)之一，主要由藻體質(zhì)量濃度和總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)共同決定。Chu等[7-8]的研究結(jié)果表明，在無(wú)N富P培養(yǎng)基中小球藻和斜生柵藻的產(chǎn)油率均最高，其中，在無(wú)N富P培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d小球藻的產(chǎn)油率為富N富P培養(yǎng)基的1.35倍，在無(wú)N富P培養(yǎng)基培養(yǎng)16 d斜生柵藻的產(chǎn)油率為富N富P培養(yǎng)基的2.00倍。本研究中，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間(培養(yǎng)10 d)，富N限P培養(yǎng)基中等鞭金藻的脂肪酸產(chǎn)率一直最高，而無(wú)N富P、無(wú)N限P和無(wú)N無(wú)P培養(yǎng)基中等鞭金藻的脂肪酸產(chǎn)率卻一直很低，結(jié)合富N富P培養(yǎng)基中等鞭金藻P吸收量最高這一結(jié)果，可以認(rèn)為在同一條件下無(wú)法同時(shí)達(dá)到獲得最大脂肪酸產(chǎn)率和廢水除P的目標(biāo)。另外，由于在富N限P條件下等鞭金藻脂肪酸產(chǎn)率最高，建議在利用等鞭金藻生產(chǎn)生物柴油的培養(yǎng)過程中減少P的投放，以降低養(yǎng)殖和生產(chǎn)成本。

3.4 等鞭金藻的油脂品質(zhì)與培養(yǎng)基中N和P濃度的關(guān)系

生物柴油的品質(zhì)與脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和不飽和度均有關(guān)，由于長(zhǎng)鏈和低不飽和度脂肪酸具有良好的低溫特性和氧化穩(wěn)定性，因此長(zhǎng)鏈和低不飽和度脂肪酸含量越高，生物柴油的品質(zhì)越好[32-33]。單不飽和脂肪酸C16∶1和C18∶1具有較好的氧化穩(wěn)定性和抗冷變形性，也是理想的生物柴油成分[33-34]?？梢?，飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸的總相對(duì)含量能決定微藻生產(chǎn)的生物柴油的品質(zhì)。

本研究中，等鞭金藻的總飽和脂肪酸相對(duì)含量及含量較高的前3種脂肪酸C18∶1n9c、C16∶0和C14∶0的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在富N無(wú)P培養(yǎng)基中最高，在富N限P和富N富P培養(yǎng)基中也較高，且組間差異較大，而在3組無(wú)N培養(yǎng)基中卻十分接近，說明富N條件下P缺乏可以提高等鞭金藻油脂的品質(zhì)，而無(wú)N條件下P濃度變化對(duì)其油脂品質(zhì)的影響卻極小。然而，在富N無(wú)P培養(yǎng)基中等鞭金藻的脂肪酸產(chǎn)率卻低于富N限P和富N富P培養(yǎng)基，因此，雖然在富N無(wú)P培養(yǎng)基中等鞭金藻的油脂品質(zhì)較好，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中其應(yīng)用價(jià)值卻極低。在富N限P培養(yǎng)基中，等鞭金藻的脂肪酸產(chǎn)率最高，C18∶1n9c、C16∶0和C14∶0以及長(zhǎng)鏈飽和及單不飽和脂肪酸C18∶0和C16∶1n9的總相對(duì)含量為65.86%， 雖然仍低于富N無(wú)P培養(yǎng)基， 但C18∶1n9c的相對(duì)含量卻高達(dá)28.19%，因此在該培養(yǎng)基中等鞭金藻的油脂品質(zhì)良好。綜合考慮脂肪酸產(chǎn)率與生物柴油品質(zhì)，認(rèn)為富N限P(80.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P)培養(yǎng)基是等鞭金藻生產(chǎn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物油脂的適宜培養(yǎng)條件。

3.5 等鞭金藻的EPA和DHA含量與培養(yǎng)基中N和P濃度的關(guān)系

生物體內(nèi)的脂肪酸合成通常以C16或C18飽和脂肪酸為終點(diǎn)，并通過去飽和及碳鏈延長(zhǎng)形成不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸[35]，在N缺乏條件下生物體內(nèi)的多不飽和脂肪酸水平大多下降[36]。本研究中，等鞭金藻的EPA和DHA產(chǎn)量在無(wú)N培養(yǎng)基中顯著低于富N培養(yǎng)基；在富N條件下，EPA相對(duì)含量隨培養(yǎng)基中P質(zhì)量濃度的下降而升高，而DHA相對(duì)含量則隨著P質(zhì)量濃度的下降而降低，說明在富N條件下，缺P可以提高等鞭金藻的EPA相對(duì)含量，但卻使其DHA的相對(duì)含量下降。然而，Reitan等[31]的研究結(jié)果顯示：隨缺P程度加劇，微藻中C18∶4n3、EPA和DHA的相對(duì)含量均下降。可見，不同P水平對(duì)各種微藻EPA相對(duì)含量的影響存在一定差異。本研究中，在富N富P培養(yǎng)基中等鞭金藻的DHA相對(duì)含量和產(chǎn)量均最高，并且其P吸收量也很高，據(jù)此認(rèn)為等鞭金藻具有同時(shí)清除廢水中P和生產(chǎn)DHA的潛力。在富N限P培養(yǎng)基中等鞭金藻的EPA產(chǎn)量最高，較其次的富N富P培養(yǎng)基高108.96%，而其DHA產(chǎn)量?jī)H比DHA產(chǎn)量最高的富N富P培養(yǎng)基低6.14%，說明在富N限P培養(yǎng)基中等鞭金藻不僅EPA產(chǎn)量最高，DHA產(chǎn)量也較高，因此，采用富N限P培養(yǎng)基培養(yǎng)等鞭金藻可以同時(shí)生產(chǎn)EPA和DHA。

綜上所述，80.00 mg·L-1NO3--N+0.25 mg·L-1PO43--P培養(yǎng)基是等鞭金藻生產(chǎn)生物柴油及EPA和DHA的最佳培養(yǎng)基。

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(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

Analyses on growth, phosphorus absorption and oil quality of Isochrysis galbana under different nitrogen and phosphorus culture conditions

YU Shijin1,2, HU Hao2, SHEN Xiaofei2, ZENG Jianxiong2，①

(1. School of Resources and Environment, Anqing Normal University, Anqing 246133, China; 2. School of Chemistry and Materials Science, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(4): 8-17

In order to explore the effects of phosphorus (P) and nitrogen (N) with different levels in medium on yield and oil quality ofIsochrysisgalbanaParke, six groups of media with P rich, P limited and P free (20.00， 0.25 and 0.00 mg·L-1PO43--P) under N rich (80.00 mg·L-1NO3--N) and N free (0.00 mg·L-1NO3--N) conditions were set up, changes in algae mass concentration, P absorption, mass fraction of total fatty acids and productivity of fatty acids, thirteen fatty acid compositions and their mass fraction, and relative content and yield of EPA and DHA ofI.galbanaculturing for 10 d were compared and analyzed. The results show that in N rich medium, increasing range of algae mass concentration ofI.galbanais obviously higher than that in N free medium, and decreases successively according to P mass concentration in medium from high to low. Overall, with prolonging of culture time, mass fraction of total fatty acids ofI.galbanaincreases continuously, and that in N rich medium is higher than that in N free medium. In which, mass fraction of total fatty acids in N rich-P limited and N rich-P free media is basically higher than that in N rich-P rich medium. Mass fraction of different fatty acid compositions in N rich medium is generally higher than that in N free medium, and that in P limited medium is generally higher than that in P rich and P free media. P absorption of 1 L algae in N rich-P rich medium is the highest (0.014 8 mg), and most of the absorbed P is stored in algae, while P absorption in N free-P rich medium decreases obviously (0.009 8 mg). In N rich-P rich medium, mass fraction and relative content of saturated fatty acids and relative content and yield of EPA all are the lowest, but relative content and yield of DHA are the highest. In N rich-P limited medium, yield of EPA and productivity of fatty acids ofI.galbanaare the highest, its DHA yield is also high; total relative contentof fivehighqualityfattyacidcompositionsincludingC18∶1n9c, C16∶0, C14∶0, C18∶0 and C16∶1n9 reaches 65.86%, especially C18∶1n9c, its relative content is up to 28.19%. The comprehensive analysis result indicates that N rich medium is beneficial to growth, P absorption and fatty acid accumulation ofI.galbana, in which, N rich-P limited medium is the suitable medium for high yield and high quality oil ofI.galbana. Otherwise,I.galbanais not only high quality resources for producing biodiesel but also potential biological resources for producing DHA and removing P in wastewater.

IsochrysisgalbanaParke; levels of nitrogen and phosphorus; microalgae growth; P absorption; oil yield; fatty acid composition

2015-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51478447)

余世金(1962—)，男，安徽岳西人，博士，副教授，主要從事環(huán)境生態(tài)學(xué)方面的研究工作。

①通信作者E-mail: rzeng@ustc.edu.cn

Q948.112+.9; S565.9； TK63

A

1674-7895(2016)04-0008-10

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.04.02