白藜蘆醇阻斷轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-/Smad通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究

宋康杰

白藜蘆醇阻斷轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-/Smad通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究

宋康杰

目的探討中藥白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞活力及侵襲轉(zhuǎn)移力的影響。方法將人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480用白藜蘆醇處理48h，MTT法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞周期的影響；Transwell穿膜試驗(yàn)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-上皮型細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)水平；Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上游磷酸化Smad蛋白（p-Smad）的表達(dá)水平。結(jié)果對(duì)照組及5、10、15、20、40μmol/L白藜蘆醇組對(duì)SW480細(xì)胞活力的抑制率分別為0、（5.4±1.0）%、（22.5±3.3）%、（36.4±4.4）%、（62.2±6.1）%、（85.1±7.5）%，各組間細(xì)胞活力抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組及5、10、15、20、40μmol/L白藜蘆醇組對(duì)SW480細(xì)胞周期G2/M阻滯率分別為（2.3±0.3）%、（4.3±0.5）%、（8.9±1.2）%、（15.6±2.3）%、（22.7± 2.7）%、（30.4±2.9）%，各組間G2/M阻滯率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （TGF-β）組、TGF-β+5μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+10μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+15μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+20μmol/L白藜蘆醇組、TGF-β+40μmol/L白藜蘆醇組穿過(guò)Transwell膜的SW480細(xì)胞數(shù)分別為（204.2±19.4）個(gè)、（453.5±41.6）個(gè)、（411.2±45.2）個(gè)、（315.7±32.7）個(gè)、（246.3±27.2）個(gè)、（197.8±23.5）個(gè)、（97.4±11.2）個(gè)，各組間細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇體外處理置于TGF-β培養(yǎng)體系中的SW480細(xì)胞后，E-cadherin表達(dá)水平顯著上升，Vimentin及MMP-9表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。白藜蘆醇顯著降低TGF-β誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞Smad蛋白磷酸化水平。結(jié)論白藜蘆醇有良好的體外抗結(jié)腸癌的生物活性，更重要的是它能通過(guò)阻斷TGF-β/Smad通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

結(jié)腸癌細(xì)胞；SW480；白藜蘆醇；轉(zhuǎn)移；TGF-β；Smad

目前認(rèn)為[1-2]，腫瘤微環(huán)境中的很多細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、肝生長(zhǎng)因子（HGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。其中，TGF-β與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系尤為密切。本研究探討中藥白藜蘆醇是否對(duì)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有抑制作用，同時(shí)研究其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480來(lái)源于美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。白藜蘆醇、噻唑藍(lán)（MTT）、TGF-β、碘化丙啶（PI）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。LY2109761購(gòu)于美國(guó)AdooQ公司。E-上皮型細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、磷酸化Smad蛋白（p-Smad）及β-肌動(dòng)蛋白（βactin）抗體購(gòu)于美國(guó)cell signaling公司。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)康寧公司。ECL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。

1.3 MTT試驗(yàn) 將SW480細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)體系中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加白藜蘆醇同樣條件培養(yǎng)48h。加入20μL 5mg/mL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。按以下公式計(jì)算SW480的細(xì)胞活力抑制率：抑制率=（對(duì)照組OD值-白藜蘆醇組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 將SW480細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔板，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。在培養(yǎng)體系中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加白藜蘆醇同樣條件培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞用生理鹽水洗2次，用70%乙醇在4℃固定過(guò)夜后用生理鹽水清洗，加入（50μg/mL）RNA酶，100μg/mL PI在暗處染色30min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，G2期細(xì)胞所占比率可表示為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G2/M阻滯[3]。

1.5 Transwell穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力

在Transwell小室中接種1×104個(gè)SW480細(xì)胞置于24孔板中，上室培養(yǎng)基為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基并加入5ng/mL TGF-β模擬腫瘤微環(huán)境。在上室中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇。下室培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48h后取出Transwell小室，用生理鹽水洗去小室內(nèi)未附著于Transwell膜的細(xì)胞，將Transwell膜用3%多聚甲醛固定20min后用0.1%結(jié)晶紫染色20min，低倍鏡（100×）觀察4個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。膜上細(xì)胞數(shù)目越多，說(shuō)明SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。

1.6 Western blot試驗(yàn) 將SW480細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔板，加入2mL含10%胎牛血清及5ng/mL 的DMEM培養(yǎng)。在培養(yǎng)體系中分別加入5、10、15、20、40μmol/L的白藜蘆醇培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加白藜蘆醇同樣條件培養(yǎng)48h。培養(yǎng)完成后將細(xì)胞裂解，取等量蛋白提取液在12.5%的丙烯酰胺中進(jìn)行SDSPAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜分別在E-cadherin、Vimentin、MMP-9、p-Smad 及β-actin抗體中孵育過(guò)夜，之后在帶辣根過(guò)氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光，于暗室中曝光X膠片，以目的蛋白與β-actin蛋白顯色后的灰度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞活力和細(xì)胞周期的影響 MTT結(jié)果和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明白藜蘆醇在體外能顯著抑制SW480的細(xì)胞活力，同時(shí)，使SW480細(xì)胞進(jìn)入G2/M阻滯，阻斷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，見(jiàn)表1。

表1 白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞活力和細(xì)胞周期的影響（±s）

表1 白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞活力和細(xì)胞周期的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與5μmol/L白藜蘆醇組比較，＃P＜0.05；與10μmol/L白藜蘆醇組比較，□P＜0.05；與15μmol/L白藜蘆醇組比較，△P＜0.05；與20μmol/L白藜蘆醇組比較，&P＜0.05.

?

2.2 白藜蘆醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell穿膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白藜蘆醇能顯著降低TGF-β誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，并使腫瘤細(xì)胞多種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)譜發(fā)生改變，見(jiàn)表2。

2.3 白藜蘆醇通過(guò)阻斷 TGF-β/Smad通路抑制SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 Western blot結(jié)果表明白藜蘆醇（20μmol/L）可顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并改變轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白譜的表達(dá)水平，TGF-β/Smad通路特異性抑制劑LY2109761[4]（5μmol/L）對(duì)SW480細(xì)胞的生物效應(yīng)與白藜蘆醇（20μmol/L）相似，證明了TGF-β/Smad通路是白藜蘆醇的靶位點(diǎn)，見(jiàn)表3。

表2 白藜蘆醇對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響（±s）

表2 白藜蘆醇對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與TGF-β組比較，§P＜0.05；與TGF-β+5μmol/L白藜蘆醇組比較，＃P＜0.05；與TGF-β+10μmol/L白藜蘆醇組比較，△P＜0.05；與TGF-β+15μmol/L白藜蘆醇組比較，□P＜0.05；與TGF-β+20μmol/L白藜蘆醇組比較，○P＜0.05；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；E-cadherin：E-上皮型細(xì)胞鈣黏蛋白；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；Vimentin：波形蛋白；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9

表3 白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞TGF-β/Smad通路的影響（±s）

表3 白藜蘆醇對(duì)SW480細(xì)胞TGF-β/Smad通路的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與5ng/mL TGF-β組比較，▲P＜0.05；p-Smad：磷酸化Smad蛋白；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；E-cadherin：E-上皮型細(xì)胞鈣黏蛋白；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；Vimentin：波形蛋白；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9

?

3 討論

研究[5-7]表明白藜蘆醇有十分良好的抗腫瘤效應(yīng)，如白藜蘆醇可上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)纖維肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；白藜蘆醇通過(guò)激活P38和JNK介導(dǎo)的H2AX磷酸化誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡；白藜蘆醇還可通過(guò)ROS途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的死亡等。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有顯著的體外抗結(jié)腸癌作用，能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力，并將結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

研究顯示，通過(guò)Transwell穿膜實(shí)驗(yàn)證明白藜蘆醇可有效抑制TGF-β介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，改變結(jié)腸癌細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)譜。E-cadherin作為一種鈣依賴性地跨膜糖蛋白，是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附反應(yīng)的重要媒介，是維護(hù)上皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完成的重要分子。研究[8]表明，E-cadherin表達(dá)的缺失可促使腫瘤細(xì)胞之間黏附力下降，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞變地松散并傾向于向周圍組織浸潤(rùn)，增加腫瘤的惡性程度。Vimentin和MMP-9是腫瘤細(xì)胞向周圍基質(zhì)細(xì)胞侵襲擴(kuò)散的必須蛋白，研究[9-10]表明，Vimentin和MMP-9基因的表達(dá)水平越高，腫瘤的惡性程度越高。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可顯著上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)Vimentin和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

TGF-β/Smad信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在這一系統(tǒng)中，TGF-β通過(guò)與TGF-βRI受體結(jié)合激活下游分子Smad發(fā)生磷酸化，激活Smad復(fù)合物。該復(fù)合物能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，如下調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平，上調(diào)Vimentin和MMP-9的表達(dá)水平，從而促進(jìn)腫瘤組織的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT），使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[11-12]。本研究結(jié)果證明，白藜蘆醇可顯著抑制TGF-β介導(dǎo)Smad磷酸化，這可能是白藜蘆醇抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究提示白藜蘆醇有潛在的抗結(jié)腸癌的生物效應(yīng)，可顯著降低結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移傾向，其機(jī)制可能為白藜蘆醇可顯著抑制TGF-β介導(dǎo)Smad磷酸化，為結(jié)腸癌的藥物治療提供了新的途徑和理論依據(jù)。

［1］Harrison SM，Knifley T，O'Connor KL，et al.LPA，HGF，and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells［J］.BMC Cancer，2013，13：501.

［2］Tian M，Neil JR，Schiemann WP.Transforming growth factorbeta and the hallmarks of cancer［J］.Cell Signal，2011，23 （6）：951-962.

［3］王錦軍.蛇床子素抑制人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和TGF-β誘導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，25（3）：246-252.

［4］Ren XF，Mu LP，Ma JF，et al.LY2109761 inhibits metastasis and enhances chemosensitivity in osteosarcoma MG-63 cells［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（7）：1182-1190.

［5］Harati K，Slodnik P，Daigeler A，et al.Resveratrol induces apoptosis and alters gene expression in human fibrosarcoma cells［J］.Anticancer Res，2015，35（2）：767-774.

［6］Wu XP，Xiong M，Lu CR，et al.Resveratrol induces apoptosis of human chronic myelogenous leukemia cells in vitro through p38 and JNK-regulated H2AX phosphorylation［J］. Acta Pharmacol Sin，2015，36（3）：353-361.

［7］Seino M，Okada M，Kitanaka C，et al.Differential contribution of ROS to resveratrol-induced cell death and loss of selfrenewal capacity of ovarian cancer stem cells［J］.Anticancer Res，2015，35（1）：85-96..

［8］Zhang Z，Yang C，Tan Y，et al.FOXA2 attenuates the epithelial to mesenchymal transition by regulating the transcription of E-cadherin and ZEB2 in human breast cancer［J］. Cancer Lett，2015，361（2）：240-250.

［9］P Lampropoulos，A Zizi-Sermpetzoglou，AG Papavassiliou，et al.TGF-beta signalling in colon carcinogenesis［J］.Cancer Lett，2012，314（1）：1-7.

［10］F Sipos，O Galamb.Epithelial-to-mesenchymal and mesenchymal-toepithelial transitions in the colon［J］.World J Gastroenterol，2012，18（7）：601-608.

［11］Geng J，F(xiàn)an J，Yu J，et al.Loss of PPM1A expression enhances invasion and the epithelial-to-mesenchymal transition in bladder cancer by activating the TGF-β/Smad signaling pathway［J］.Oncotarget，2014，5（14）：5700-5711.

［12］Jung HY，F(xiàn)attet L，Yang J.Molecular pathways:linking tumor microenvironment to epithelial-mesenchymal transition in metastasis［J］.Clin Cancer Res，2014，21（5）：962-968.

（收稿：2015-05-06 修回：2015-08-07）

Resveratrol Inhibited the Metastasis of Colon Cancer SW480 Cells Via Suppressing the TGF-/Smad Path－way

SONG Kangjie. Department of Pharmacy,Ningbo Beilun Maternal＆Child Care Hospital,Ningbo(315800),China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on the cell viability and metastasis in SW480 cells in vitro.MethodsSW480 cells were treated with resveratrol for 48h:the cell viability was measured by MTT assay,the cell cycle was evaluated by flow cytometry analysis,and the metastasis was evaluated by Transwell assay. Metastasis associated proteinsE-cadherin,vimentin and MMP-9 in SW480 cells treated with resveratrol were detected by using Western Blot analysis.The upstream pathway proteinphosphorylated Smad（p-Smad）was detected in SW480 cells treated with resveratrol by Western Blot analysis.Results Cell viability inhibitory rate of SW480 cells in control group,5μmol/L resveratrol group,10μmol/L resveratrol group,15μmol/L resveratrol group,20μmol/L resveratrol group,and 40μmol/L resveratrol group were 0,（5.4±1.0）%,（22.5±3.3）%,（36.4±4.4）%,（62.2±6.1）%, and（85.1±7.5）%,respectively,with a significant difference among them（P＜0.05）.The cell cycle G2/M inhibitory rate of SW480 cells in above groups were as follows:（2.3±0.3）%，（4.3±0.5）%，（8.9±1.2）%，（15.6±2.3）%，（22.7± 2.7）%，and（30.4±2.9）%,with a significant differenceamong groups（P＜0.05）.The number of cells thatpenetrated the Transwell membrane in control group,TGF-β group,TGF-β+5μmol/L resveratrol group,TGF-β+10μmol/L resvera－trol group,TGF-β+15μmol/L resveratrol group,TGF-β+20μmol/L resveratrol group,and TGF-β+40μmol/L resveratrol group were as follows:204.2±19.4,453.5±41.6,411.2±45.2,315.7±32.7,246.3±27.2,197.8±23.5,97.4±11.2, with a significant differenceamong groups（P＜0.05）.Western blot analysis showed the expression of E-cadherin was significantly up-regulated,while the Vimentin and MMP-9 were down-regulated by resveratrol treatment in SW480 cells（all P＜0.05）.The expression ofp-Smad was significantly down-regulated when SW480 cells were treated with resveratrol.ConclusionResveratrol showed a significant anti-tumor effect in human colon cancerin vitro.More importantly,resveratrol could inhibit the metastasis of SW480 cells via suppressing the TGF-/Smad pathway.

colon cancer cells;SW480;resveratrol;metastasis;TGF-β;Smad

浙江省寧波市北侖區(qū)婦幼保健院藥劑科（寧波 315800）