CX3CR1多態(tài)性與中藥治療2型糖尿病腎病尿蛋白療效的關(guān)系

朱阿楠方亞君王利峰陳洪宇

CX3CR1多態(tài)性與中藥治療2型糖尿病腎病尿蛋白療效的關(guān)系

朱阿楠1方亞君1王利峰1陳洪宇2

目的觀察CX3CR1-V249I基因多態(tài)性與中藥治療2型糖尿病腎病療效的關(guān)系。方法糖尿病腎病患者108例隨機(jī)分為對(duì)照組（西醫(yī)治療）和中藥組（西醫(yī)治療聯(lián)合中藥參芪地黃湯加減），予相應(yīng)治療3個(gè)月。全部患者治療開(kāi)始前均接受CX3CR1-V249I基因多態(tài)性檢測(cè)。治療前、后檢測(cè)糖化血紅蛋白、尿白蛋白、尿α1微球蛋白（α1MU）、血β2微球蛋白（β2MU）、趨化因子Fmetalkine（FKN）、核因子-κb（NF-κb）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。結(jié)果108例中CX3CR1-V249I野生型（VV）87例，突變型（Ⅵ+Ⅱ）21例。治療后兩組不同基因型患者尿白蛋白、尿α1MU、血β2MU較治療前均有明顯下降（P＜0.05）。中藥組突變型療效明顯優(yōu)于對(duì)照組突變型［尿白蛋白：（642.7±42.1）mg/L比（815.4±59.7）mg/L，P＜0.05；尿α1MU：（73.21±10.06）mg/L比（84.5±11.01）mg/L，P＜0.05；血β2MU：（37.42±9.04）mg/L比（51.12±10.57）mg/L，P＜0.05］。中藥組治療后血清NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量較治療前明顯減少（P＜0.05）；與對(duì)照組突變型比較，中藥組突變型患者下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［NF-κb：（0.32±0.07）ng/mL比（0.53±0.09）ng/mL，P＜0.05；FKN：（0.75±0.09）ng/mL比（0.91±0.14）ng/mL，P＜0.05；IL-6：（121.21±22.65）pg/mL比（140.26± 22.1）pg/mL，P＜0.05；TNF-α：（57.16±8.31）ng/mL比（69.12±16.55）ng/mL，P＜0.05］。結(jié)論參芪地黃湯能有效減少2型糖尿病腎病患者尿白蛋白、尿α1MU、血β2MU、FKN、NF-κb、IL-6、TNF-α含量，保護(hù)腎臟組織，這一作用在CX3CR1-V249I突變型患者中更加明顯。

糖尿病腎??；參芪地黃湯；CX3CR1；V249I；基因多態(tài)性；炎癥介質(zhì)

糖尿病腎?。―N）屬中醫(yī)“消渴、虛勞、腰痛、水腫”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為其病機(jī)以陰虛為本、燥熱為標(biāo)；西醫(yī)認(rèn)為DN是多種因素共同作用的結(jié)果，有學(xué)者認(rèn)為DN是一種炎癥性疾病[1]。近年發(fā)現(xiàn)FKNCX3-CR1是介導(dǎo)腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的重要因子[2]。本研究分析糖尿病腎病患者CX3CR1基因中V249I位點(diǎn)多態(tài)性分布情況，應(yīng)用中藥參芪地黃湯加減治療DN前后測(cè)定相關(guān)炎癥介質(zhì)及尿微量白蛋白的含量，探討CX3CR1基因多態(tài)性與炎癥介質(zhì)對(duì)DN病理生理過(guò)程的影響，分析中藥對(duì)于DN患者V249I基因非野生與野生型是否同樣有效。

1 臨床資料

1.1 一般資料 108例均為2009年1月—2013年12月本院門(mén)診或住院DN患者，采用SPSS程序完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分組將患者分為中藥組54例，男34例，女20例，平均年齡（62.56±10.34）歲，平均糖尿病病程（9.20±2.35）年。對(duì)照組54例，男36例，女18例，平均年齡（58.99±9.01）歲，平均糖尿病病程（8.50±2.01）年。兩組年齡、性別及病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者在治療開(kāi)始前接受V249I基因檢測(cè)，簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷及排除標(biāo)準(zhǔn) 診斷均符合1999年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)[3]，尿微量白蛋白排泄率30～300mg/24h，符合早期糖尿病腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除由原發(fā)性腎病、發(fā)熱、泌尿系感染、原發(fā)性高血壓、心力衰竭等原因引起的尿蛋白，無(wú)嚴(yán)重心、腦、肝臟及其他內(nèi)分泌疾病，無(wú)近期使用腎毒性藥物史。中醫(yī)診斷：消渴；納入陰虛熱盛、氣陰兩虛、陰陽(yáng)兩虛3型[4]。

2方法

2.1 治療方法 兩組患者均予糖尿病教育及飲食控制，對(duì)照組予口服降糖藥物或皮下注射胰島素，合并高脂血癥者予阿托伐他汀片20mg，每晚1次，口服調(diào)脂治療。中藥組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用參芪地黃湯加減：黨參、山藥、澤瀉各15g，黃芪30g，山萸肉15g，丹皮10g，茯苓、生地各12g。氣虛明顯者加重參芪用量為黨參20g，黃芪45g；陰虛甚者加玄參、知母各10g；陽(yáng)虛甚者加附片（先煎）、肉桂粉（后下）各3g。1 天1劑，水煎分兩次服用；每周5天，休息2天，總療程3個(gè)月。

2.2 CX3CR1-V249I基因多態(tài)性檢測(cè) 治療前行人

外周血全血基因組DNA提取及CX3CR1基因多態(tài) 性分析。受試者常規(guī)禁食12h以上，空腹抽取肘靜脈

血5mL，EDTA-K2抗凝，置于-70℃低溫冰箱保存。

取300μL全血，利用外周血DNA提取試劑盒提取基 因組DNA，樣本吸光度OD260/OD280比值在1.7～

2.0，DNA濃度為50～150ng/μL。根據(jù)基因文庫(kù)調(diào)取的CX3CR1基因序列，使用Prime5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由杭州艾迪康醫(yī)學(xué)研究中心合成上游引物：上游引物：5’TCATCCAGACGCTGTTTTCC-3’，下游引物：5’-GGCATTTCCCATACAGGTG-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，總長(zhǎng)為588bp。NCBI上進(jìn)行BLAST，確認(rèn)為目的基因，符合研究設(shè)計(jì)。使用限制性內(nèi)切酶AclⅠ對(duì)V249I酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切。

2.3 觀察指標(biāo)及方法 兩組患者治療前后禁食12h以上，次日晨空腹采肘部靜脈血液6mL，采血前避免劇烈活動(dòng)及應(yīng)激等，血標(biāo)本靜置1h左右（室溫），3000r/min離心10min后分離血清，分裝保存于-70℃冰箱中待檢。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血清趨化因子Fmetalkine（FKN）、核因 子-κb（NF-κb）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因 子-α（TNF-α）濃度；應(yīng)用西門(mén)子BN-2全自動(dòng)免疫分析儀，采用散射比濁法檢測(cè)尿白蛋白及尿α1微球蛋白（α1MU）；應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血β2微球蛋白（β2MU）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析，計(jì)量資料以（±s） 表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Hardy-Weinberg平衡 兩組患者CX3CR1基因多態(tài)性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.5792），說(shuō)明群體基因遺傳平衡來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w。

3.2 CX3CR1基因V249I酶切結(jié)果 結(jié)果顯示，V249I多態(tài)位點(diǎn)中，出現(xiàn)1條條帶295bp，為突變型 純合子Ⅱ型，出現(xiàn)2條條帶104bp和191bp，為野生型純合子VV型，出現(xiàn)3條條帶104bp、191bp和295bp，為雜合子Ⅵ型。見(jiàn)圖1。其中對(duì)照組VV型44例，Ⅵ型8例，Ⅱ型2例；中藥組VV型43例，Ⅵ型9例，Ⅱ型2例。

圖1CX3CR1基因V249I酶切電泳結(jié)果

3.3 兩組治療前后腎病指標(biāo)比較 治療前同組內(nèi)V249I野生型（VV基因型）患者較突變型（Ⅵ+Ⅱ基因型）患者尿白蛋白、α1MU、血β2MU含量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后兩組患者糖化血紅蛋白含量均有降低，但各組同一基因型治療前后無(wú)明顯變化（P＞0.05）；兩組不同基因型尿中白蛋白、尿α1MU、血β2MU較治療前均有明顯下降（P＜0.05）；中藥組中突變型者療效明顯優(yōu)于對(duì)照組突變型者（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3.4 兩組不同基因型患者治療前后血清炎癥介質(zhì)含量比較 治療前，同組內(nèi)V249I野生型患者NF-κB、IL-6、TNF-α含量高于突變型患者，F(xiàn)KN含量低于突變型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組中突變型患者NF-κB、TNF-α含量治療后較治療前降低（P＜0.05）；中藥組中無(wú)論突變型患者還是野生型患者血清NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量治療后較治療前均明顯減少（P＜0.05）；中藥組突變型患者血清NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量比對(duì)照組突變型下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3.5 不良反應(yīng) 中藥組出現(xiàn)輕微肝功能損害3例，予停藥及保肝治療后轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常。

表1 兩組不同基因型患者治療前后腎病指標(biāo)比較

表2 兩組不同基因型患者血清炎癥介質(zhì)含量比較

4 討論

DN是糖尿病（DM）最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，有研究[2]證明，fractalkine/CX3CR1是介導(dǎo)腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的重要因子。FKN與CX3CR1結(jié)合以后，通過(guò)與G-蛋白偶聯(lián)，激活蛋白激酶C（PKC），形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)單核細(xì)胞表達(dá)TNF-α和NF-κB，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[5]。近年發(fā)現(xiàn)CX3CR1基因中存在V249I堿基突變，這種遺傳變異對(duì)CX3CR1和FKN的親和力產(chǎn)生明顯影響，并影響炎癥過(guò)程中白細(xì)胞的游走、黏附和聚集，進(jìn)一步影響DN的遺傳易感性[6]。中醫(yī)認(rèn)為DN病機(jī)以陰虛或氣陰兩虛為主，且因消渴日久，耗氣傷津灼液，氣虛津虧液少而成瘀血，因此中醫(yī)治療多采用補(bǔ)腎滋陰加活血化瘀為主[7-8]。

本課題組以往研究[9]中發(fā)現(xiàn)，DN患者NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量較健康對(duì)照者明顯升高，說(shuō)明這些炎癥介質(zhì)在DN發(fā)病中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，同組內(nèi)V249I野生型患者尿中白蛋白、α1MU、血β2MU、NF-κB、IL-6、TNF-α含量高于突變型患者，F(xiàn)KN含量低于突變型患者（P＜0.05）。雖然突變型患者FKN含量較高，但CX3CR1-V249I突變型對(duì)FKN的趨化活性下降，與FKN的結(jié)合率也降低[9]。而DN患者CX3CR1-V249I野生型相對(duì)突變型而言，CX3CR1表達(dá)增加，對(duì)FKN的趨化活性增強(qiáng)，F(xiàn)KN-CX3CR1系統(tǒng)激活，單核細(xì)胞表達(dá)NF-κB和TNF-α增加，腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的損傷，促進(jìn)了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展；NF-κB的增加促使血清IL-6升高并刺激腎小球系膜增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，使腎小球?yàn)V過(guò)膜增厚[5，10]，加速了DN的發(fā)生發(fā)展。

參芪地黃湯源于清沈金鰲《沈氏尊生書(shū)》，由黨參、黃芪、生地、山藥、山茱萸、茯苓6味藥組成，功效為益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎。方中黨參、黃芪、生地共為君藥。黃芪助脾運(yùn)以升清，助腎之氣化與封藏以固攝精微，合黨參以增強(qiáng)補(bǔ)氣之功；生地黃與黨參、黃芪合用，健脾補(bǔ)中而不溫燥，益腎養(yǎng)陰而不滋膩。山茱萸、山藥、茯苓共為臣藥。山茱萸滋陰澀精，山藥滋腎補(bǔ)脾，茯苓淡而平，健脾益氣，滲濕利水，與山藥相須為用，共助君藥健脾補(bǔ)腎，益氣養(yǎng)陰。澤瀉清瀉腎火，牡丹皮清瀉肝火，并制山茱萸之溫；佐以丹參、桃仁活血祛瘀。在補(bǔ)益藥物中配以活血祛瘀藥，可使補(bǔ)益藥物無(wú)滋膩壅滿之弊。全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀之

功[11]。

本研究顯示，中藥組尿白蛋白、α1MU、β2MU等指標(biāo)治療后明顯改善，在V249I突變型患者中尤為明顯。而且中藥組患者服用參芪地黃湯治療3個(gè)月后，NF-κb、FKN、IL-6、TNF-α含量較治療前均有明顯減少，與對(duì)照組同基因型患者相比，突變型患者治療效果更加明顯。說(shuō)明參芪地黃湯加減可抑制糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)，降低NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α等炎癥因子的含量，進(jìn)一步減少糖尿病腎病患者尿白蛋白、α1MU、β2MU等相關(guān)指標(biāo)。中藥益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀的功效可延緩糖尿病腎病的發(fā)展，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Yamagishi S，Matsui T，Nakamura K，et al.Olmesartan blocks inflammatory reactions in endothelial cells evoked by advanced gyrations end products by suppressing generation of reactive oxygen species［J］.Ophthalmic Res，2008，40（1）：10-15.

［2］Segerer S，Hughes E，Hudkins KL，et al.Express ion of the fractalkine receptor（CX3CR1）in human kidney diseases ［J］.Kidney Int，2002，62（32）：488-495.

［3］陸菊明，潘長(zhǎng)玉.糖尿病腎病的流行病學(xué)和診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.中華老年多器官雜志，2002，1（3）：163-165．

［4］國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002：233-237，283-285．

［5］Zanchi C，Zoja C，Morigi M，et al.Fractalkine and CX3CR1 mediate leukocyte capture by endothelium in response to Shiga toxin［J］.J Immunol，2008，181（2）：1460-1469.

［6］Keith D Brown，Estefania Claudio，Ulrich Siebenlist，et al. The roles of the classical and alternative nuclear factorkappa B pathways：potential implications for autoimmunity and rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2008，10（4）：212-225.

［7］丁英鈞，王世東，傅強(qiáng)，等.糖尿病腎病中醫(yī)證型文獻(xiàn)評(píng)價(jià)［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（2）：183-186．

［8］向少偉，王小琴.糖尿病腎病中醫(yī)病因病機(jī)研究進(jìn)展［J］.湖北中醫(yī)雜志，2011，23（2）：77-78．

［9］劉亞君，朱阿楠，許紅，等.糖尿病腎病患者CX3CR1基因V249I多態(tài)性與炎癥介質(zhì)的關(guān)系［J］.中國(guó)血液凈化，2014，13（7）：515-519.

［10］Mora C，Navarro JF.Inflammation and diabetic nephropathy ［J］.Curr Diab Rep，2006，6（6）：463-468.

［11］馮志瑀，李玉珠.加味參芪地黃湯加減治療早期2型糖尿病氣陰兩虛夾瘀證療效觀察［J］.新中醫(yī)，2013，1（12）：93-96.

（收稿：2015-06-18 修回：2015-09-09）

Correlation of Gene Polymorphism of CX3CR1 with the Effect of Traditional Chinese Medicine on UrineProteinsin Patients with Type 2 Diabetic Nephropathy

ZHU A'nan1,FANG Yajun1,WANG Lifeng1,CHEN Hongyu2. 1 Department of Internal Medicine,Traditional Chinese Medicine Hospital of Yuyao City,Yuyao(315400), China;2 Department of Nephrology,Hangzhou Chinese Medical Hospital(310006),China

ObjectiveTo investigate the relationship between CX3CR1-V249Igene polymorphism and the effect of Chinese medicineon treatment of type 2 diabetic nephropathy.MethodsA total of 108 patients were randomly divided intocontrol group（western medicine therapy alone）and Chinese medicine group（western medicine combined with Chinese medicine Shengqi Dihuang Decoction）.Patients in each group received the corresponding treatment for consecutive 3 months.Blood HbA1c,urinary albumin,urinary α1MU,serumβ2MU,FKN,NF-κb,IL-6,and TNF-αwere measured before and after treatment.ResultsEighty-seven patients had VV wild genotype of CX3CR1-V249Igene,and another 21 patients had non-wild genotype（VI+II）.The level of urinary albumin,urinary α1MU andserumβ2MU were decreased in both groups after treatment（P＜0.05）.Compared to patients with VI+II genotype in control group,those in Chinese medicine group had lower levels of urinary albumin（642.7±42.1mg/L vs 815.4±59.7mg/L）,urinary α1MU（73.21±10.06mg/L vs 84.5±11.01mg/L）andserumβ2MU（37.42±9.04mg/L vs 51.12± 10.57mg/L）,with all P＜0.05.The levels of NF-κB,FKN,IL-6 and TNF-α were decreased after Chinese medicine treatment（P＜0.05）,especially in patients with VI+II genotype（NF-κB:0.32±0.07ng/mL vs 0.53±0.09ng/mL;FKN: 0.75±0.09ng/mL vs 0.91±0.14ng/mL;IL-6:121.21±22.65pg/mL vs 140.26±22.1pg/mL;TNF-α:57.16±8.31ng/mL vs 69.12±16.55ng/mL;all P＜0.05）.ConclusionShengqi Dihuang Decoction could decrease the levels of urinary albumin and urinary α1MU,serum β2MU,FKN,NF-κb,IL-6,and TNF-α and attenuate inflammation in kidneyinpatients with type 2 diabetic nephropathy.This effect is more obvious in patients with non-wild genotype of CX3CR1-V249Igene.

diabetic nephropathy;Shengqi Dihuang Decoction;CX3CR1;V249I;gene polymorphism;mediators of inflammation

浙江省余姚市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009Y11）

1浙江省余姚市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科（朱阿楠）、腎內(nèi)科（方亞君、王利峰）（余姚 315400）；2杭州市中醫(yī)院腎內(nèi)科（杭州 310006）

朱阿楠，Tel：13738402869；E-mail：yylinyanrong@163.com