能量代謝儀系統(tǒng)在針灸干預(yù)急性酒精性肝損傷中的應(yīng)用＊

李順月，宋曉晶，王淑友，張 棟

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所 北京 100070）

能量代謝儀系統(tǒng)在針灸干預(yù)急性酒精性肝損傷中的應(yīng)用＊

李順月，宋曉晶，王淑友，張 棟＊＊

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所 北京 100070）

目的：探討能量代謝監(jiān)測(cè)儀系統(tǒng)在針灸改善酒精性肝損傷大鼠能量代謝研究的應(yīng)用價(jià)值。方法：將34只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和電針組。模型組和電針組大鼠用50%乙醇給予灌胃，造成急性酒精肝損傷的動(dòng)物模型。電針組造模后每天給予足三里穴電針30 min治療一次,共治療3天。使用動(dòng)物能量代謝系統(tǒng)對(duì)各組動(dòng)物同期進(jìn)行連續(xù)96 h的觀察，全程記錄呼吸商（Respiratory Exchange Ratio，RER）、熱量、飲食量和飲水量。結(jié)果：急性酒精性肝損傷模型大鼠的RER、飲水飲食量顯著降低，熱量增高；電針干預(yù)具有增加RER、飲水飲食量和降低熱量值的趨勢(shì)。結(jié)論：將能量代謝監(jiān)測(cè)儀系統(tǒng)應(yīng)用于針灸干預(yù)急性酒精性肝損害大鼠能量代謝的研究表明該儀器系統(tǒng)具有一定的實(shí)用價(jià)值。

能量代謝 呼吸商 熱量 飲食量 急性酒精性肝損傷

能量代謝一般是通過(guò)呼吸商、熱量值、飲食和飲水量這些指標(biāo)之間的關(guān)系來(lái)體現(xiàn)，新型的動(dòng)物能量代謝檢測(cè)系統(tǒng)可以無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地同步記錄以上各項(xiàng)指標(biāo)，為相關(guān)疾病的診斷和治療效果的評(píng)估提供了客觀、便捷的研究手段[1]。肝臟是物質(zhì)和能量代謝的重要器官，各種肝臟損傷都可能導(dǎo)致能量代謝的異常。大量飲酒會(huì)損傷肝臟，影響肝臟代謝，進(jìn)而影響機(jī)體的能量代謝[2]。目前，動(dòng)物能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)于酒精性肝損傷能量代謝變化的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少，在針灸研究中更為少見(jiàn)。因此，為了提高動(dòng)物能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在針灸研究中的應(yīng)用價(jià)值，在應(yīng)用能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)急性酒精性肝損傷大鼠能量代謝進(jìn)行評(píng)估的基礎(chǔ)上，結(jié)合電針對(duì)急性酒精性肝損傷能量代謝的干預(yù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以體現(xiàn)動(dòng)物能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在針灸研究中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康成年SD大鼠34只，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量200±10 g。健康對(duì)照組（對(duì)照組）10只，酒精性肝損傷模型組（模型組）和酒精性肝損傷模型+電針組（電針組）各12只，模型組和電針組隨機(jī)選取2只進(jìn)行病理檢測(cè)。大鼠由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK-（軍）2007-004]。所有大鼠均以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)待，整個(gè)實(shí)驗(yàn)程序?qū)凑毡驹簞?dòng)物倫理委員會(huì)的原則進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Oxymax Lab Animal Monitoring System能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Columbus公司）用于本實(shí)驗(yàn)的觀察，本儀器系統(tǒng)由8通道系統(tǒng)架和8個(gè)大鼠標(biāo)準(zhǔn)倉(cāng)，8通道的熱量計(jì)、喂食質(zhì)量監(jiān)測(cè)模塊、飲水體積模塊和8通道接口、軟件和控制器等構(gòu)成。

1.3 能量代謝的記錄

3組大鼠隨機(jī)放入能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的觀察箱中，并連續(xù)觀察96 h。除造模組（觀察開(kāi)始后4 h時(shí)）和電針組（觀察開(kāi)始后的18、42、66 h時(shí)）過(guò)程被暫時(shí)移出觀察箱外，其余時(shí)間均在箱內(nèi)生活。飲食在觀察前已添加足量，由能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的聯(lián)機(jī)計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄和計(jì)算出RER、熱量、飲食量和飲水量數(shù)值。

1.4 急性酒精肝損傷模型制備和成功與否的判定

在將大鼠放入能量代謝儀、觀察4 h正?；A(chǔ)代謝后，模型組合電針組動(dòng)物用濃度50%乙醇按12 mL·kg-1（bw）的計(jì)量給予灌胃1次，形成急性酒精性肝損傷。隨機(jī)選取模型組和電針組各2只大鼠，于造模24 h后處死，取肝組織做石蠟切片并進(jìn)行HE染色，見(jiàn)組織中出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索排列紊亂，肝竇變窄，肝細(xì)胞核分裂的形態(tài)學(xué)變化，即為急性肝損害模型成功[3]。

1.5 電針?lè)椒?/p>

電針組在造模18、42、66 h時(shí)進(jìn)行3次電針治療，用0.18 mm×13 mm華佗牌針灸針直刺雙側(cè)“足三里”穴（位于小鼠后肢膝關(guān)節(jié)外下方當(dāng)腓骨小頭下約3 mm處）；將針灸針連接電針儀（MBT-1微電腦脈搏同步脈沖治療儀，浙江華音電子有限公司），電針參數(shù)選用連續(xù)波，輸出電壓5 V，頻率1 Hz，以后肢出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為度，電針時(shí)間為30 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)儀器自帶的CLAX v2.24軟件程序，將RER、熱量值、飲食和飲水量在觀察開(kāi)始0、造模后2、8、20、32、44、56、68、80、92 h共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值進(jìn)行提取，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分別將三組10個(gè)時(shí)間點(diǎn)均數(shù)值進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后進(jìn)一步做多樣本均數(shù)間的多重比較以分析兩組間的差別，當(dāng)方差性齊（P＞0.05）進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)，不齊時(shí)（P＜0.05）進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。三組10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）做出各組量值各時(shí)間點(diǎn)的折線圖。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物RER變化比較

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，P=0.44，方差齊，進(jìn)一步LSD-t檢驗(yàn)后，模型組與對(duì)照組有顯著性差異（P=0.023），電針組與對(duì)照組有顯著性差異（P=0.049）。

經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)后，模型組與對(duì)照組在造模2 h（P=0.000）和8 h（P=0.002）時(shí)的顯著性比80 h（P=0.03）和92 h（P=0.03）時(shí)有所增加；電針組與對(duì)照組在造模2 h（P=0.00）和44 h（P=0.008）時(shí)的顯著性比8 h（P=0.03）和20 h（P=0.04）時(shí)有所增加。

在96 h的觀察過(guò)程中，模型組和電針組動(dòng)物呼吸商與對(duì)照組比較一直處于較低水平；在造模2 h時(shí)模型組和電針組動(dòng)物RER達(dá)到最低，分別為模型組0.79±0.04，電針組0.81±0.07，而對(duì)照組0.95±0.03；在造模80、92 h時(shí)，模型組仍處于較低水平，而電針組則明顯高于模型組但仍低于對(duì)照組；本結(jié)果說(shuō)明，急性酒精性肝損傷動(dòng)物的RER降低，電針治療3次后具有提高RER作用的趨勢(shì)（圖1）。

2.2 各組動(dòng)物熱量變化比較

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，P=0.60，方差齊，進(jìn)一步LSD-t檢驗(yàn)后各組間均沒(méi)有顯著性差異。

經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)后，電針組在造模8 h時(shí)為1.77±0.58，模型組在32 h時(shí)為2.09±0.68，與對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

在96 h的觀察過(guò)程中，與對(duì)照組比較，模型組和電針組動(dòng)物熱量值在造模后至造模44 h均較高。在造模44 h后，三組的熱量值接近。本項(xiàng)觀察結(jié)果說(shuō)明，酒精性肝損傷在造模2天內(nèi)，熱量明顯增加；電針組較模型組稍低，但對(duì)增加熱量的降低作用不明顯（圖2）。

2.3 各組動(dòng)物飲食量變化比較

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，P=0.82，方差齊，進(jìn)一步LSD-t檢驗(yàn)后各組間均沒(méi)有顯著性差異。

經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)后，模型組與對(duì)照組在造模8 h（P=0.004）比2 h（P=0.030）、32 h（P=0.040）和80 h（P=0.040）的顯著性有所增加；電針組與對(duì)照組在造模8 h（P=0.012）和56 h（P=0.046）時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

在96 h的觀察過(guò)程中，對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)食量出現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性變化，模型組和電針組動(dòng)物則是在造模20 h前明顯減少，造模32 h后模型組和電針組也恢復(fù)晝夜節(jié)律，并有代償和波動(dòng)性增減；與對(duì)照組比較，在造模后56 h時(shí)，模型組和電針組進(jìn)食量增加，造模80 h時(shí)，模型組動(dòng)物進(jìn)食量又減少較多，電針組則與對(duì)照組接近。觀察結(jié)果說(shuō)明，酒精性肝損傷動(dòng)物造模1天內(nèi)進(jìn)食量明顯減少，電針在造模2天后具有一定增加進(jìn)食量的作用（圖3）。

2.4 各組動(dòng)物飲水量變化比較

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，P=0.23，方差齊，進(jìn)一步LSD-t檢驗(yàn)后各組間均沒(méi)有顯著性差異。

經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)后，模型組與對(duì)照組在造 模 8 h時(shí)（P=0.020）出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；電針組與對(duì)照組在造模8 h時(shí)（P=0.010） 比 2 h時(shí)（P=0.045）的顯著性有所增加；電針組與模型組在造模44 h時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.007）。

在96 h的觀察過(guò)程中，對(duì)照組動(dòng)物飲水量出現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性變化；模型組和電針組動(dòng)物則是在造模20 h前明顯減少，造模20 h后模型組和電針組也恢復(fù)晝夜節(jié)律，并與對(duì)照組接近。觀察結(jié)果說(shuō)明，酒精性肝損傷造模1天內(nèi)飲水量明顯減少，電針在飲水量的調(diào)節(jié)作用不顯著（圖4）。

圖1 各組呼吸商比較

圖2 各組熱量比較

圖3 各組飲食量比較

3 討論

機(jī)體依靠呼吸功能從外界攝取氧，以供各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化分解的需要，同時(shí)也將代謝終生物CO2呼出體外。因此，一定時(shí)間內(nèi)機(jī)體的CO2產(chǎn)量與耗氧量的比值稱為RER，RER能夠反映機(jī)體糖、蛋白、脂肪3大營(yíng)養(yǎng)底物氧化分解情況，是反映機(jī)體的能量代謝情況一項(xiàng)重要指標(biāo)[4]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，智能能量測(cè)定系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的氧耗量和CO2產(chǎn)生量、熱量值以及飲食、飲水等生命代謝指標(biāo)進(jìn)行即刻、動(dòng)態(tài)、精確測(cè)量[5]。目前，能量代謝檢測(cè)系統(tǒng)主要用于糖尿病[6]、肥胖癥[7]、內(nèi)分泌[8]等代謝性疾病代謝機(jī)理研究，并用于食物、藥物、活動(dòng)等干預(yù)對(duì)代謝及代謝疾病的影響研究分析[9-11]，但在針灸干預(yù)研究中的應(yīng)用研究報(bào)道較少。本研究首次應(yīng)用動(dòng)物能量代謝檢測(cè)系統(tǒng)觀察急性酒精性肝損傷動(dòng)物的能量代謝變化以及針刺對(duì)其的影響作用。

圖4 各組飲水量比較

在本研究中所使用的動(dòng)物能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)是通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物所在籠內(nèi)吸入和呼出氣體前后的氧氣和CO2濃度變化，監(jiān)測(cè)動(dòng)物的氧氣消耗和CO2產(chǎn)生，儀器系統(tǒng)通過(guò)公式計(jì)算此過(guò)程中的能量消耗；該儀器系統(tǒng)配置了飲食和飲水模塊，食物稱量采用了賽多利斯天平，質(zhì)量控制精度0.01 g；飲水檢采用了精密的電子泵技術(shù)，確保動(dòng)物每次飲水量固定在20 μL，避免飲水外漏導(dǎo)致測(cè)量誤差，同步檢測(cè)動(dòng)物飲水和飲水消耗，綜合分析該過(guò)程中的能量代謝情況。該儀器系統(tǒng)可無(wú)人職守自動(dòng)運(yùn)行72 h或更長(zhǎng)時(shí)間，通過(guò)軟件程序化控制記錄各項(xiàng)指標(biāo)，具有無(wú)創(chuàng)、精確、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、便捷的優(yōu)勢(shì)。

本研究應(yīng)用該儀器對(duì)急性酒精性肝損傷的能量代謝改變進(jìn)行了觀察，急性大量酒精灌胃后，模型大鼠的RER主要呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明酒精性損傷后耗氧量明顯增加，并持續(xù)到觀察結(jié)束，這是該損傷的一個(gè)病理特征。熱量消耗在整個(gè)觀察過(guò)程的前半時(shí)段呈升高趨勢(shì)，在48 h后逐漸下降并接近正常組，表明大量乙醇攝入后的分解代謝并產(chǎn)生熱能直接相關(guān)。飲水飲食量在觀察的4天內(nèi)具有明顯的晝夜節(jié)律，這是動(dòng)物生活習(xí)性造成。同時(shí)，在造模初期，由于大量攝入乙醇，模型動(dòng)物的飲食量、飲水量顯著下降。應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法對(duì)酒精性肝損傷所做的肝臟HE染色顯示，大量乙醇灌胃后，大鼠肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索排列紊亂，肝竇變窄，有些肝細(xì)胞已經(jīng)腫脹、變形，說(shuō)明急性酒精性肝損傷模型造模成功[3]。此前，用激光散斑血流成像方法觀察到急性酒精灌胃后小鼠肝臟血流灌注量顯著減少[18]。以上結(jié)果表明酒精造成了動(dòng)物肝臟組織的病理性改變，引起了肝臟功能損傷。肝臟功能損傷后，肝臟的正常代謝功能必然低下，進(jìn)而影響全身的代謝機(jī)能。Piche等[12]觀察到慢性丙型肝炎患者呈現(xiàn)高能量代謝狀態(tài)。Greco等[13]發(fā)現(xiàn)58%肝硬化患者能量代謝基本正常，而僅有12%為低能量代謝狀態(tài)。更多研究者則認(rèn)為肝硬化患者呈高能量代謝狀態(tài)[14]。因此，本研究中觀察到模型動(dòng)物出現(xiàn)代謝增加狀態(tài)可能與急性酒精攝入引起的肝損傷有關(guān)。大量酒精攝入同時(shí)也會(huì)引起機(jī)體其他系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)，因此動(dòng)物的日常飲食量、飲水量也出現(xiàn)了變化。這一結(jié)果也與肝臟疾病會(huì)出現(xiàn)能量代謝異常的臨床表現(xiàn)符合。

我們觀察到急性酒精性肝損傷動(dòng)物的RER降低，電針治療介入后，增加了RER，電針治療3次后具有提RER商作用的趨勢(shì)。觀察時(shí)段的后期，大鼠熱量值逐步下降，電針對(duì)增加熱量的降低作用不明顯。造模1天內(nèi)進(jìn)食量明顯減少，造模2天后和電針干預(yù)后，飲食量逐步恢復(fù)，可能與電針的干預(yù)作用有關(guān)，但還可能是乙醇在體內(nèi)代謝基本完成造成。在臨床治療中，針灸療法對(duì)于多種肝臟疾病的調(diào)治效果顯著。有研究表明針刺具有調(diào)節(jié)肝功能，促進(jìn)肝臟病變恢復(fù)的功用[15-17]。在我們以往的研究中觀察到，針灸對(duì)肝臟血流灌注有一定的調(diào)節(jié)作用[18]，對(duì)急性酒精性損傷大鼠的肝臟功能也有一定的保護(hù)作用[4]。在本研究中我們也觀察到電針能對(duì)急性酒精性損傷大鼠的能量代謝有一定調(diào)整作用，這可能與電針作用促進(jìn)肝臟功能恢復(fù)有關(guān)，電針對(duì)酒精性肝損傷能量代謝影響的研究還有更多的工作有待進(jìn)行。

4 結(jié)論

本研究首次應(yīng)用動(dòng)物能量代謝系統(tǒng)觀察到急性酒精性肝損傷后大鼠的能量代謝增高；電針刺激在促進(jìn)急性酒精性肝損傷大鼠的RER和飲食量增加、熱量下降方面具有一定作用。

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Application of the Animal Energy Metabolism Monitoring System (AEMMS) in Acute Alcoholic Liver Injury with the Treatment of Acupuncture

Li Shunyue, Song Xiaojing, Wang Shuyou, Zhang Dong
(Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100070, China)

This study aimed to explore the value of animal energy metabolism monitoring system (AEMMS) to evaluate the energy metabolism of acute alcohol liver injury in rat with the treatment of acupuncture. Tirty rats were randomly divided into the control group, the model group and the EA group. The model group and the EA group were gavaged with 50% ethanol for the establishment of the animal model of acute alcoholic liver injury. EA was given by needling Zusanli (ST-36) 30 min after intragastic administration every day in the EA group. The treatment of acupuncture continued 3 days. In addition, the RER, heat, feeding and drinking were continuouslyrecorded for 96 h in each group at the same time by AEMMS. As a result, the RER, feeding and drinking indices significantly decreased in rats with ALI with an increase in the heat index. There was an up-going tendency of the RER, feeding and drinking indices, and a declined tendency of the heat index in the model rats after EA treatment. It was concluded that AEMMS presented a practical value in the study of the energy metabolism of rats with ALI with the treatment of acupuncture.

Energy metabolism, respiratory exchange ratio, heat, feeding, acute alcoholic liver injury

10.11842/wst.2016.12.023

R245

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-03-28

修回日期：2016-12-13

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81273834）：多模式成像技術(shù)對(duì)針灸肝臟血管調(diào)節(jié)作用的顯示及其機(jī)理研究，負(fù)責(zé)人：張棟；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題項(xiàng)目（Zz08005）：針灸對(duì)酒精性肝損傷小鼠的血管調(diào)控作用的機(jī)理研究，負(fù)責(zé)人：李順月。

＊＊ 通訊作者：張棟，研究員，主要研究方向：針灸機(jī)理與經(jīng)絡(luò)研究。