低溫冷凍酶解法制備牛骨粉工藝研究

陳靜怡，肖厚榮*，楊紅，張靖華，張佩佩，朱許燕

（1.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601；2.安徽華伊美科技企業(yè)集團(tuán)，安徽合肥230088）

低溫冷凍酶解法制備牛骨粉工藝研究

陳靜怡1，肖厚榮*1，楊紅1，張靖華2，張佩佩1，朱許燕1

（1.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601；2.安徽華伊美科技企業(yè)集團(tuán)，安徽合肥230088）

以牛骨為原料，采用低溫冷凍和生物酶解相結(jié)合的技術(shù)制備超微骨粉。在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合實驗設(shè)計原理采用響應(yīng)面實驗法，以超微牛骨粉得率和鈣生物利用率算術(shù)加權(quán)（即綜合得分）為考察指標(biāo)，對制備的技術(shù)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明：實驗范圍內(nèi)，最佳的技術(shù)參數(shù)為酶用量0.22 g，酶解時間4.20 h，酶解溫度41℃；在該條件下，綜合得分最高為76.23。

牛骨；低溫冷凍；酶解；響應(yīng)面

我國是畜牧業(yè)大國，畜禽生產(chǎn)和消耗總量均位于世界前列[1]，畜禽骨資源十分豐富，但是綜合利用率低，其中深加工、高值化和資源化利用比例不到3%，大量畜禽骨資源被隨意丟棄，造成資源浪費和環(huán)境污染[2-3]。實驗表明，人體利用動物骨組織進(jìn)行補(bǔ)鈣是最為理想的補(bǔ)鈣方式[4-5]。根據(jù)2015年國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展統(tǒng)計公報顯示，全年牛肉產(chǎn)量達(dá)到700萬噸。牛骨約占牛胴體質(zhì)量的20%~40%，富含蛋白質(zhì)、鈣、磷、維生素、微量元素等物質(zhì)，還含有豐富的骨膠原蛋白和軟骨素[6-7]。牛骨相比于豬骨、羊骨，由于其體積過大、質(zhì)地堅硬，普通居民家庭難以加工食用[8]。我國集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，飼養(yǎng)密度及飼養(yǎng)量急劇增加，屠宰加工過程中產(chǎn)生的牛骨量不斷增多。牛骨中的鈣含量[9]在20%~30%，是一種優(yōu)良的鈣源補(bǔ)充劑[10-11]。Field[12-13]的研究表明，110μm以下的骨粒可以直接被人體胃液溶解，因此本試驗選用200目（110 μm=140目）骨粉得率作為考察指標(biāo)之一。骨粉作為天然的補(bǔ)鈣制劑，其吸收利用率一直備受關(guān)注，對于鈣而言，被吸收的鈣離子都可以被機(jī)體所利用，儲存在骨中鈣也具有其生理功能，所以鈣的吸收率可以表征骨粉的鈣生物利用率。本文采用低溫冷凍和生物酶解相結(jié)合的方法制備牛骨粉，以200目以下牛骨粉得率和鈣生物利用率作為綜合考察指標(biāo)，為了便于整體分析，將兩個考察指標(biāo)按照百分比進(jìn)行量化，以綜合得分（100）作為考察依據(jù)，其中200目以下骨粉得率和鈣生物利用率各占50%。在單因素實驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計，通過工藝優(yōu)化，制備出高鈣、高得率的超微骨粉，并分析測定其營養(yǎng)元素成分，為骨資源深加工及其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨購于合肥市周谷堆農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場。乙酸乙酯（AR）、乙酸(AR)、鹽酸（AR）、胃蛋白酶（酶活1:3 000），上海源聚生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-3C型pH計，上海精宏科學(xué)儀器有限公司；HJ-5型多功能攪拌器，金壇市晶玻實驗儀器廠；HZP-150型全溫震蕩培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；NB-86-150-WA型超低溫冰箱，鄭州南北儀器有限公司；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；100目、200目標(biāo)準(zhǔn)篩，新鄉(xiāng)市東漢機(jī)械有限公司。

1.3 方法

工藝流程：新鮮牛肋骨預(yù)處理→低溫冷凍處理→粗粉碎→脫脂→酶解→干燥→超微粉碎過篩→分裝。

綜合考察指標(biāo)：綜合得分=200目以下骨粉得率×50+鈣生物利用率×50（1）

單因素實驗。考察冷凍溫度（-25，-50，-80℃）、冷凍時間（12，24，36，48 h）、脫脂時間（2，3，4, 5，6 h）、酶用量（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g）酶解時間（1，2，3，4，5，6 h）、酶解溫度(35，40，45，50，55℃)對綜合得分的影響。

響應(yīng)面優(yōu)化實驗。為進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝，參照單因素實驗結(jié)果，選擇酶用量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）3個影響因素，各取3個水平，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 三因素三水平響應(yīng)面分析試驗設(shè)計表

測定方法。200目骨粉得率（%）=（200目篩下物÷超微后骨粉重量）×100%；鈣的生物利用測定：體外模擬吸收法[14]；優(yōu)化工藝條件后制得的骨粉樣品依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測蛋白質(zhì)（GB/T5009. 5-2010）、水分（GB50093-2010）、灰分（GB/T9695. 18-2008）、鈣（GB/T9695.13-2009）、磷（GB/T 9695.4-2009）、氨基酸含量（GB/T 5009.124-2003）。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍溫度對牛骨粉制備的影響

冷凍溫度對牛骨粉制備的影響如圖1所示。

圖1 冷凍溫度對牛骨粉制備的影響

由圖1可以看出，隨著冷凍溫度的降低，骨粉的綜合得分不斷增加。分析原因可知，隨著溫度的降低，牛骨的硬度和脆性增加[15]，溫度越低，牛骨的玻璃化程度越高，在相同外力作用下更易破碎，得率更高；牛骨在玻璃態(tài)下，其結(jié)構(gòu)組分反應(yīng)十分緩慢[16]，各方面性質(zhì)穩(wěn)定，在酶解過程中損失更小，從而生物利用率增加，綜合得分升高。

2.2 冷凍時間對牛骨粉制備的影響

冷凍時間對牛骨粉制備的影響如圖2所示。

圖2 冷凍時間對牛骨粉制備的影響

由圖2可知，冷凍時間越長，綜合得分越高。在快速降溫的過程中，牛骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生不均勻收縮產(chǎn)生內(nèi)應(yīng)力，在內(nèi)應(yīng)力的作用下，物料內(nèi)部薄弱部位產(chǎn)生裂紋從而使牛骨內(nèi)部組織結(jié)合力降低[17]，冷凍時間越長，內(nèi)應(yīng)力作用越大，結(jié)合力降低程度越高，在同等外力破碎時，得率越高。

2.3 脫脂時間對牛骨粉制備的影響

脫脂時間對牛骨粉制備的影響如圖3所示。

由圖3可知，脫脂時間越長，綜合得分越高，當(dāng)脫脂時間達(dá)到4 h以后，其綜合得分基本保持不變。牛骨中脂肪含量約為20%[18]，高含量的脂肪會影響牛骨酶解過程中其結(jié)構(gòu)組織中蛋白質(zhì)的溶出和鈣的吸收，同時由于脂肪的粘連性會影響骨粉的破碎及后續(xù)的篩分，從而影響骨粉的綜合得分。脫脂時間增加，脂肪去除率增大，綜合得分增加，4 h后變化不大。綜合考慮，脫脂時間應(yīng)確定為4 h。

圖3 脫脂時間對牛骨粉制備的影響

2.4 酶解時間對牛骨粉制備的影響

酶解時間對牛骨粉制備的影響如圖4所示。

圖4 酶解時間對牛骨粉制備的影響

由圖4可以看出，隨著酶解時間的增加，牛骨粉的綜合得分先升高后降低。牛骨中大量的骨膠原使其難以粉碎，導(dǎo)致骨粉得率不高[19]。酶解可以促進(jìn)牛骨中的蛋白質(zhì)分解，出現(xiàn)微小孔洞，內(nèi)部結(jié)合力減弱[20]，在超微粉碎時，得率增加，同時酶解時間越長，牛骨水解程度越大，鈣生物利用率越高，從而綜合得分升高。但是，隨著酶解時間繼續(xù)增加，酶解效果持續(xù)增強(qiáng)，骨中的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)一步溶出，從而導(dǎo)致骨粉得率下降，綜合得分降低，酶解時間應(yīng)控制在4 h。

2.5 酶用量對牛骨粉制備的影響

酶用量對牛骨粉制備的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著酶用量的增加，酶解作用充分，骨粉的粉碎效果和生物利用率均呈上升趨勢，綜合得分上升。當(dāng)酶用量增加到一定程度時，與底物的作用達(dá)到飽和，綜合得分達(dá)到一定的穩(wěn)定狀態(tài)，而后隨著酶用量的持續(xù)增加，骨粉中營養(yǎng)物質(zhì)溶出，得率下降，從而致使綜合得分略微下降，酶用量達(dá)到0.2 g以后，綜合得分增加幅度很小，從經(jīng)濟(jì)成本考慮，最適酶用量應(yīng)控制在0.2 g。

圖5 酶用量對牛骨粉制備的影響

2.6 酶解溫度對牛骨粉制備的影響

酶解溫度對牛骨粉制備的影響如圖6所示。

圖6 酶解溫度對牛骨粉制備的影響

由圖6可知，酶解溫度在40℃時，綜合得分達(dá)到最大值，隨著溫度的繼續(xù)升高，得分降低。由生物酶學(xué)可知，溫度對酶的反應(yīng)速度的影響具有雙重性，在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高，反應(yīng)速度加快，然而隨著溫度繼續(xù)上升，酶活性呈下降趨勢，導(dǎo)致生物利用率降低，骨粉得率降低，綜合得分降低。

2.7 響應(yīng)面實驗最佳條件分析

2.7.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。采用Design Expert8.0.5統(tǒng)計分析軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，綜合得分的回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表3。對17組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立響應(yīng)面回歸模型，分別得到回歸方程，以綜合得分為響應(yīng)值Y：

表2 實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 綜合得分方差分析

由表3可知模型P<0.001，失擬項P表示模型與實驗擬合的程度，該實驗中P為0.847 0不顯著，表明回歸方程對實驗擬合情況較好，決定系數(shù)（R2）的范圍在0~1之間，R2越接近1表明此模型與數(shù)據(jù)擬合程度越高，回歸方程的R2值為0.994 2，實驗結(jié)果與模型計算結(jié)果無顯著性差異。因素A，B，C的P值均小于0.001，說明因素A，B，C對綜合得分的影響是極顯著的；A2，B2，C2的P值也均小于0.001，說明A2，B2，C2對綜合得分的影響也是極顯著的；交互項BC的P值小于0.001，說明交互項BC規(guī)綜合得分的影響是極顯著的；交互項AC的P值為0.024 0小于0.05，說明AC對綜合得分的影響是顯著的，交互項AB的P值為0.068 3大于0.05，說明交互項AB對綜合得分沒有顯著性影響。由F值知，各因素對牛骨粉制備綜合得分的影響因素為從高到低依次為酶用量（A），酶解溫度（C），酶解時間（B）。

2.7.2 響應(yīng)面分析

酶用量、酶解時間、酶解溫度因素之間的交互作用響應(yīng)面曲線圖如圖7~9所示。

圖7 酶用量、酶解時間及其交互作用對綜合得分的響應(yīng)面曲線

圖8 酶用量、酶解溫度及其交互作用對綜合得分的響應(yīng)面曲線

圖9 酶解溫度、酶解時間及其交互作用對綜合得分的響應(yīng)面曲線

由圖7~9可知，酶用量（A）和酶解時間（B）兩因素間交互作用不明顯，酶用量（A）和酶解溫度（C）兩因素交互作用顯著，酶解時間（B）和酶解溫度（C）兩因素交互作用極顯著。

運用Design Expert8.0.5軟件對響應(yīng)面實驗結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)反應(yīng)條件為酶用量為0.22 g，酶解時間為4.19 h，酶解溫度為40.94℃。在此條件下，綜合得分為76.472 4。在進(jìn)行驗證實驗時，考慮到實驗的操作性，對實驗條件進(jìn)行了略微修改：酶用量為0.22 g，酶解時間為4.20 h，酶解溫度為41℃，在該條件下，綜合得分為76.23，與理論值接近，響應(yīng)面優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.8 營養(yǎng)學(xué)分析

對最佳實驗條件下制備的骨粉進(jìn)行成分分析，結(jié)果如表4、5所示。

表4 牛骨粉營養(yǎng)成分含量

表5 牛骨粉中氨基酸含量

由表4和5分析可知，低溫冷凍酶解法制備的牛骨粉營養(yǎng)成分含量較高，其中蛋白質(zhì)含量為37.67%、鈣含量為23.87%、磷含量為9.35%、水分含量為5.64%、灰分含量為77.35%。氨基酸分析儀結(jié)果顯示牛骨粉中含15種氨基酸，含量為25.77%，其中必需氨基酸含量占5.00%。

3 結(jié)論

本文采用低溫冷凍和生物酶相結(jié)合的技術(shù)制備超微骨粉。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對酶解條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，綜合考慮骨粉得率和鈣生物利用率，采用綜合得分作為考察指標(biāo)，得到最佳工藝參數(shù)：酶用量為0.22 g，酶解時間為4.20 h，酶解溫度為41℃，此參數(shù)下，骨粉的綜合得分為76.23，與理論預(yù)測值非常接近。骨粉營養(yǎng)學(xué)分析表明，牛骨粉中蛋白質(zhì)含量為37.67%、鈣含量23.87%、磷含量9.35%、水分含量5.64%、灰分含量77.35%、氨基酸含量25.77%，具有較高的營養(yǎng)價值。

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Temperature Freezing and Biological Enzymatic HydrolysisMethod

CHEN Jing-yi1，XIAO Hou-rong1，YANG Hong1，ZHANG Jin-hua2，ZHANG Pei-pei1，ZHU Xu-yan1
(1.Departmentof Biological and Environmental Engineering，Hefei University，Hefei，Anhui 230601，China; 2.AnhuiHuayimei Technology Group，Hefei，Anhui230088，China）

The bone powder is produced with the jointly use of low temperature freezing and biological enzymatic hydrolysis.On the basis of single factor test,response surface method which is based on the central composite experimental design principle is used to optimize the process for the preparation of bone powder with the weighted average(comprehensive score)of the bone yield and bioavailability as index.Optimal preparation process conditions are enzyme dosage 0.22 g,time of enzymatic hydrolysis 4.20 h,temperature of enzymatic hydrolysis 41℃,atwhich the comprehensive score is 76.23.

cattle bone；low temperature freezing；biological enzymatic hydrolysis；response surface

Q819

A

1007-4260(2016)04-0092-05

時間：2017-1-3 17:19

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1150.N.20170103.1719.024.html

2016-06-28

安徽省科技攻關(guān)項目（1301032168）。

陳靜怡，女，安徽潁上人，合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系碩士研究生，研究方向為生物化學(xué)、食品生化。

Email:1178405517@qq.com

肖厚榮，男，安徽廬江人，博士，合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系教授，研究方向為生物化學(xué)、食品科學(xué)、食品加工和功能性食品。Email:xhr@hfuu.edu.cn

10.13757/j.cnki.cn34-1150/n.2016.04.024