氨基糖苷類抗生素混合物對蛋白核小球藻的時間依賴毒性

董欣琦，陳 敏，張 瑾,2，洪桂云

（1. 安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601；2. 清華大學(xué)新興有機(jī)污染物控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084）

氨基糖苷類抗生素混合物對蛋白核小球藻的時間依賴毒性

董欣琦1，陳 敏1，張 瑾1,2，洪桂云1

（1. 安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601；2. 清華大學(xué)新興有機(jī)污染物控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084）

越來越多的研究表明，污染物在不同暴露時間具有不同的毒性變化規(guī)律。以4種氨基糖苷類抗生素，硫酸安普霉素（APR）、雙氫鏈霉素(DIH)、硫酸新霉素(NEO)和硫酸鏈霉素(STS)為混合物組分，應(yīng)用直接均分射線法和均勻射線法對4類抗生素設(shè)計(jì)出6組二元混合體系和4組三元混合體系，每個混合物體系設(shè)計(jì)5條射線共50條射線，采用時間毒性微板分析法(T-MAT)測定這些抗生素混合物射線在6個暴露時間點(diǎn)(即0、12、24、48、72和96 h)對蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的生長抑制毒性。結(jié)果表明，抗生素二元和三元混合物系的50條射線對C.pyrenoidosa毒性均具有明顯的時間依賴性，即混合物射線的毒性隨著暴露時間的延長而增強(qiáng)；以半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的負(fù)對數(shù)pEC50為毒性指標(biāo)，不同混合物體系的時間毒性變化規(guī)律不同，有的混合物從0 h開始，毒性隨時間延長逐漸增強(qiáng)，有的從12 h或24 h，甚至48 h后，毒性開始迅速增加；同一混合物體系中不同射線的毒性因組分濃度比的變化而變化，即混合物射線的毒性隨毒性大的組分比例增加而增強(qiáng)。

氨基糖苷類抗生素；混合物；蛋白核小球藻；微板毒性分析；時間依賴毒性

0 引 言

已有研究表明污染物的毒性不僅與濃度有關(guān)，暴露時間也是一個重要的因素[1,2]，如6種三嗪類除草劑對發(fā)光菌Q67的毒性隨著時間的延長而逐漸增加[3]。重金屬如（Pb，Cd等）對三類水生生物：三葉浮萍、虹鱒魚和大型蚤均具有明顯的時間依賴毒性[4]。

抗生素(antibiotics)被大規(guī)模的用于人和動物的疾病治療，同時以亞治療劑量添加于動物飼料中，因其含有能干擾其它生物細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)，所以具有預(yù)防動物疾病和促進(jìn)生長的作用。氨基糖苷類抗生素是一種廣譜性殺菌劑，因其價廉、高效尤其是對嚴(yán)重的細(xì)菌感染有效，而在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用[5]。然而，大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收，高達(dá)85%以上的抗生素以原形或代謝形式經(jīng)由病人和畜禽糞尿排入環(huán)境，經(jīng)不同途徑對土壤和水體造成污染[6]。進(jìn)入環(huán)境中的抗生素會對環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)包括細(xì)菌，水生生物，土壤生物和植物等產(chǎn)生危害，甚至產(chǎn)生大量耐藥菌，對人類健康構(gòu)成危害[7]。T.Backhaus等[8]研究表明費(fèi)氏弧菌對于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的高劑量抗生素敏感。然而，環(huán)境中的污染物，并非單獨(dú)存在，而是不可避免地以各種形式或濃度與環(huán)境中其它污染物混合存在，進(jìn)而對環(huán)境生物產(chǎn)生聯(lián)合毒性效應(yīng)[9]?；旌衔廴疚锏睦鄯e毒性與相互作用具有更大的潛在風(fēng)險。目前，對于抗生素的毒性研究雖然很多，但有關(guān)氨基糖苷類抗生素的毒性研究很少[10-14]。因此，開展抗生素及其混合物時間毒性的研究具有重要的實(shí)際意義。

在我們過去的研究中，發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素對蛋白小球藻的毒性具有明顯的時間依賴性[15]。因此，本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，選擇了4種氨基糖苷類抗生素作為混合物組分，以蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)為測試生物，分別應(yīng)用直線均分射線(EquRay)法[16]和均勻設(shè)計(jì)射線(UD-Ray)法[17]設(shè)計(jì)氨基糖苷類抗生素的代表性二元和三元混合物體系，運(yùn)用時間毒性微板分析法(T-MAT)測定這些抗生素混合物體系在6個暴露時間節(jié)點(diǎn)(即0、12、24、48、72和96 h)的毒性。研究結(jié)果將為抗生素的環(huán)境安全性與風(fēng)險評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：4種抗生素：硫酸安普霉素(APR)、雙氫鏈霉素(DIH)、硫酸新霉素(NEO)和硫酸鏈霉素(STS)均購自上海原葉生物科技有限公司，其基本理化性質(zhì)見表1。采用milli-Q配制抗生素儲備液，保存在棕色瓶中，置于4 ℃冰箱，備用。

表1 4種抗生素的基本理化性質(zhì)

主要儀器：BioRad酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)、MGC-250型智能型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、BT25S型五位電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、70SW-CJ-IF超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)和Dragon-lab單道可調(diào)移液器(10-100μL)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)[15]。

1.2 混合物設(shè)計(jì)方法

為了考察四種抗生素混合物毒性隨濃度和時間變化規(guī)律，直接均分射線法[16]和均勻設(shè)計(jì)射線法[17]分別用于設(shè)計(jì)四種抗生素的代表性二元(BM)和三元(TM)混合物體系，每組混合物體系包括5條具有不同濃度比(pi，i=1,2,3,4,5)的混合物射線(Ri,i=1,2,3,4,5)(表2)，每條射線設(shè)計(jì)12個不同的濃度。

表2 混合物組分及其濃度配比濃度比

BM5 pNEOpSTRBM6 pDIHpNEOTM1 pDIHpNEOpAPRR1 9.673E-01 3.265E-02 R1 4.272E-01 5.728E-01 R1 7.33E-03 1.11E-01 8.82E-01 R2 9.222E-01 7.783E-02 R2 2.297E-01 7.703E-01 R2 3.34E-02 6.34E-01 3.33E-01 R3 8.556E-01 1.444E-01 R3 1.298E-01 8.702E-01 R3 1.99E-02 2.82E-02 9.52E-01 R4 7.476E-01 2.524E-01 R4 6.939E-02 9.306E-01 R4 7.05E-02 2.83E-01 6.46E-01 R5 5.423E-01 4.577E-01 R5 2.896E-02 9.710E-01 R5 2.57E-02 1.73E-01 8.02E-01 TM2 pDIHpSTRpAPRTM3 pDIHpSTRpNEOTM4 pNEOpSTRpAPRR1 8.16E-03 1.00E-02 4.97E-01 R1 3.35E-02 4.12E-02 4.89E-01 R1 4.75E-02 9.64E-03 4.98E-01 R2 7.68E-02 1.58E-01 4.53E-01 R2 1.79E-01 3.68E-01 3.56E-01 R2 3.44E-01 1.12E-01 4.53E-01 R3 2.04E-02 1.87E-03 5.00E-01 R3 8.54E-02 7.82E-03 4.98E-01 R3 1.19E-01 1.68E-03 5.00E-01 R4 9.47E-02 9.64E-02 4.90E-01 R4 2.80E-01 1.07E-01 4.60E-01 R4 4.09E-01 2.37E-02 4.90E-01 R5 3.02E-02 2.48E-02 4.94E-01 R5 1.17E-01 9.60E-02 4.71E-01 R5 1.23E-01 2.11E-02 4.94E-01

1.3 藻種培養(yǎng)、時間毒性測試與毒性計(jì)算

蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，其培養(yǎng)基采用SE培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配制和藻培養(yǎng)過程參見文獻(xiàn)[15]。

氨基糖苷類混合物體系中的50條射線的時間毒性采用T-MAT測定[15]。為了避免邊緣效應(yīng)，96微孔板的四周36孔加200 ul蒸餾水，在第2列、6列、7列和11列的24個孔中分別加入100 uL蒸餾水作為空白。然后，將配制好的每條混合物射線的12個不同濃度分別加入第3列的6個孔(ci,i=1,2,3,4,5,6)以及第8列的6個孔(ci,i=7,8,9,10,11,12)中，每孔均為100 uL；第4和5列是第2列的平行實(shí)驗(yàn)，第9和1 0列是第8列的平行實(shí)驗(yàn)。最后在空白和處理孔共60個孔中分別加入已經(jīng)培養(yǎng)好的藻液100 μL，余下操作詳見參考文獻(xiàn)[15]。

以污染物對C.pyrenoidosa的生長速率μ的抑制率(E)為毒性指標(biāo)，計(jì)算不同暴露時間終點(diǎn)污染物的毒性：

式中，Ei,j為污染物濃度ci(i=1,2, 3,…,12)在暴露時間終點(diǎn)j(j=0、12、24、48、72和96 h) 對C.pyrenoidosa的生長速率抑制率；μi,j為微板中污染物濃度ci處理孔中CP在暴露時間終點(diǎn)j時的平均生長速率；μ0,j為微板中空白藻在暴露時間終點(diǎn)j(j=0、12、24、48、72和96 h)的平均生長速率。

1.4 時間毒性數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理所用到函數(shù)模型和方法均參見文獻(xiàn)[15]。2個用于描述實(shí)驗(yàn)毒性數(shù)據(jù)的非線性函數(shù)Weibull和Logit如式(2)和(3)所示：

式中α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數(shù)，E為效應(yīng)即污染物對綠藻CP的生長抑制率；c是污染物的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 二元混合物對蛋白核小球藻的時間-濃度-效應(yīng)

Logit函數(shù)能較好地?cái)M合抗生素污染物的時間毒性數(shù)據(jù)[15,18]，且抗生素具有明顯的時間依賴毒性。本論文中，Logit函數(shù)也能較好地?cái)M合氨基糖苷類抗生素二元混合物對綠藻的時間毒性數(shù)據(jù)，6個二元混合物體系30條混合物射線的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)及擬合的濃度-效應(yīng)(CRC)曲線如圖1所示。從圖1可以看出，6個氨基糖苷類抗生素二元混合物體系的30條混合物射線對綠藻的毒性也具有明顯的時間依賴性，即隨暴露時間的延長，毒性逐漸增強(qiáng)。但不同的混合物體系，毒性隨時間變化的規(guī)律稍有不同，如APR-DIH的5條射線的對蛋白核小球藻的毒性隨時間的延長，毒性在逐漸增強(qiáng)，而APR-NEO、APR-STS和NEO-DIH的5條射線在0 ～ 24 h無明顯毒性，但24 h后毒性迅速增強(qiáng)，72 h毒性增強(qiáng)很慢甚至不增強(qiáng)。而NEO-STS和DIH-STS的二元混合在0 ～ 12 h幾乎沒有毒性，在12 h后毒性快速增強(qiáng)。

圖1 6組二元抗生素混合物射線在6個時間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)曲線

續(xù)圖1 6組二元抗生素混合物射線在6個時間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)曲線

2.2 二元混合物體系毒性隨時間的變化規(guī)律

以EC50的負(fù)對數(shù)值pEC50值為毒性指標(biāo)，六個二元混合物體系的30條射線的毒性pEC50隨時間的變化曲線見圖2。從圖2可看出，6個二元混合物的pEC50值均隨時間的延長而逐漸增大，其中DIH-STS混合體系的5條射線的pEC50值隨時間延長的增加速度最快，其它混合物體系的5條射線均是逐漸增加；但6個混合物體系除NEO-STS體系在24 h就能達(dá)到50%的效應(yīng)，其它混合物射線均是在48 h才能達(dá)到50%的效應(yīng)；但同一種混合物體系不同射線的pEC50值差別不同，如NEO-STS 的5條射線的pEC50值差別相對較大，而APR-DIH的差別相對較小，如在暴露時間節(jié)點(diǎn)24 h時，APR-NEO混合物5條射線毒性大小順序：R5＜R4 ＜R3＜R1＜R2；在暴露時間節(jié)點(diǎn)48 h時，毒性大小順序R 1＜R 3＜R 5＜R 4＜R 2;在暴露時間節(jié)點(diǎn)7 2 h時，毒性大小順序R 5＜R 4＜R 3＜R 1 ＜R2；在暴露時間節(jié)點(diǎn)96 h時，毒性大小順序R5＜R4＜R3＜R2＜R1。這可能是由于混合物不同射線的具有毒性差異的組分濃度比不同造成的，如NEO-STS中STS (pEC50=4.68)的毒性大于NEO的pEC50(3.76)[15]，表2中從R 1到R 5中S T S的濃度比越來越大，其pEC50值也越來越來越大；又如DIH和STS的毒性較接近pEC50(4.59)，因此DIH-STS混合體系各條射線的毒性隨濃度比變化不明顯。

2.3 三元混合物對蛋白核小球藻的時間-濃度-效應(yīng)曲線

Logit也能較好地描述四組三元混合物體系中20條射線的在不同時間的毒性數(shù)據(jù)。四個三元抗生素混合物體系中20條射線在不同時間的毒性數(shù)據(jù)的擬合CRC如圖3所示。圖3顯示，三元混合物毒性也具有明顯的時間依賴性，其變化規(guī)律與二元混合物稍有不同，即毒性隨時間逐漸增強(qiáng)，而不是從某個時間點(diǎn)如24 h突然快速增強(qiáng)。

2.4 4個三元混合物體系20條射線的毒性隨時間變化規(guī)律

以EC50的負(fù)對數(shù)值pEC50為毒性指標(biāo)，四組三元混合物5條射線pEC50值隨時間變化的規(guī)律見圖4。從圖4可看出，三元混合物體系與二元混合物的pEC50值隨時間變化規(guī)律相似，即具有明顯的時間依賴性，但4個混合物體系除NEO-STS-APR中的5條射線和DIH-NEO-APR中的R1以及DIHSTS-NEO中的R1射線在24 h就能達(dá)到50%的效應(yīng)，其它混合物射線均是在48 h才能達(dá)到50%的效應(yīng)；不同的混合物體系的pEC50值隨時間延長，增加速率不同，其中DIH-STR-APR的pEC50在暴露時間內(nèi)增加幅度大，曲線較陡，其它3個三元混合物體系的pEC50值增加平緩；同一種混合物體系不同射線的pEC50值差別不同，NEO-STS-APR的5條射線的pEC50值差別較明顯，而其它三個混合體系中5條射線的pEC50值差別不明顯，可能是由于NEO、STS和APR的差別較大[15]；同一種混合物體系的5條射線在同一時間點(diǎn)的毒性也不相同，如在暴露時間節(jié)點(diǎn)24 h時，DIH-NEO-APR混合物5條射線毒性大小順序：R3＜R5＜R1＜R4＜R2；在暴露時間節(jié)點(diǎn)48 h時，毒性大小順序：R3＜R1＜R5 ＜R2＜R4;在暴露時間節(jié)點(diǎn)72 h時，毒性大小順序：R2＜R1＜R5＜R4＜R3;在暴露時間節(jié)點(diǎn)96 h時，毒性大小順序：R4＜R2＜R5＜R3＜R1。對照中DIH-NEO-APR的DIH的濃度比變化規(guī)律與5條射線中DIH濃度比的變化規(guī)律一致。

圖2 6個二元混合物體系30條射線的pEC50隨時間的變化曲線

圖3 4組4種抗生素混合物在6個時間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)曲線

圖4 四組三元混合物五條射線在不同暴露時間內(nèi)pEC50的變化曲線

3 結(jié)論

本文應(yīng)用T-MTA法測定了10個氨基糖苷類抗生素兩元和三元混合體系的50條射線對C.pyrenoidosa的時間毒性?？股氐亩腿旌衔飳.pyrenoidosa的毒性均具有明顯時間依賴性，即隨暴露時間越長，毒性逐漸增強(qiáng)：在開始的12 h內(nèi)幾乎沒有毒性，然后隨暴露時間的延長，毒性迅速增強(qiáng)，到達(dá)72 h后毒性增加緩慢甚至不再增強(qiáng)。以半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的負(fù)對數(shù)pEC50為毒性指標(biāo)，不同混合物體系的時間毒性變化規(guī)律不同，有的從0 h開始，毒性逐漸增強(qiáng)，有的從12 h后開始逐漸增強(qiáng)或快速增強(qiáng)；有的混合物從24 h開始，毒性迅速增強(qiáng)，有的從48 h毒性迅速增強(qiáng)。同一混合物體系中不同射線的pEC50值因組分濃度比的變化而變化，毒性大的組分比例增加，其混合物射線的毒性也相應(yīng)增強(qiáng)。

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Time-dependent Toxicity of Aminoglycoside antibiotics to Chlorella pyrenoidosa

DONG Xinqi1, CHEN Min1, ZHANG Jin1,2, HONG Guiyun1

(1. Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province, College of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei 230601, China；2. Beijing Key Laboratory for Emerging Organic Contaminants Control, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

More and more researches published have shown that some pollutants have different toxicitychanging laws at different exposure times. Four aminoglycoside antibiotics including apramycin sulfate, dihydrostreptomycin sesquisulfate, neomycin sulfate and strepomycin sulfate being selected as the mixture components, six binary and four ternary mixture systems (containing fifty rays in all) were designed by the direct equipartition ray design and uniform design ray methods, respectively. The toxicities of the fifty rays in six binary and four ternary mixture systems to Chlorella pyrenoidosa were determined by using the timedependent microplate toxicity analysis (T-MAT) method at six different exposure times such as 0, 12, 24, 48, 72 and 96 h. The results showed that all the fifty mixture rays exhibited clear time-dependent toxicity, i.e. toxicity increased with time lengthening. Selecting the negative logarithm of mean effect concentration (pEC50) value as a toxicity index, toxicity changing laws of different mixture systems varied with the exposure time lengthening. Toxicities of some mixture rays gradually increased from the exposure time of 0 h, while the toxicities of other mixture rays gradually or rapidly increased after 12 h or 24 h, even 48 h. The pEC50 values of different rays in the same mixture system changed with the mixture ratios of the component with higher toxicity, i.e., the toxicity of a mixture ray increased with the increasing of mixture ratios of the component with higher toxicity.

Aminoglycoside antibiotics; Chlorella pyrenoidosa; microplate toxicity analysis; time-dependent toxicity.

X13

A

2095-8382(2016)06-067-07

10.11921/j.issn.2095-8382.20160615

2016-01-26

國家自然科學(xué)基金(No.21207002)；天津市水質(zhì)科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金(TJKLAST-ZD-2014-03)；安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No.KJ2013A067)。

董欣琪(1991-)，女，研究生，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)。