間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病的研究進(jìn)展

徐承雷 綜述， 宋振順 審校

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院肝膽胰外科，上海 200072)

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·綜 述·

間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病的研究進(jìn)展

徐承雷 綜述， 宋振順 審校

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院肝膽胰外科，上海 200072)

糖尿病尤其是1型糖尿病(T1DM)，很大程度上與先天免疫缺陷有關(guān)，自身免疫攻擊導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的破壞和胰島素分泌不足，目前尚無有效方法根治糖尿病。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有強(qiáng)大的增殖分化能力及免疫調(diào)節(jié)功能。迄今為止，MSCs不論在體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生產(chǎn)胰島素細(xì)胞(IPCs)，還是動(dòng)物試驗(yàn)，均表現(xiàn)出令人鼓舞的效果，但研究仍處于早期階段。本文介紹MSCs體外衍生為IPCs，作為一種潛在的治療方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型以及在人體中的應(yīng)用。

間充質(zhì)干細(xì)胞； 糖尿??； 誘導(dǎo)分化； 產(chǎn)胰島素細(xì)胞；

研究[1]顯示，目前中國(guó)有超過1.1億的糖尿病患者，約占全球糖尿病患者的1/3。但只有約1/4患者在接受糖尿病治療，其中血糖水平控制良好的患者數(shù)量更少。世界正面臨前所未有的糖尿病流行的問題，而中國(guó)已經(jīng)成為全球糖尿病疾病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家之一，預(yù)防和控制糖尿病的發(fā)生和發(fā)展是擺在政府和公眾面前一個(gè)重要的問題。

1 糖尿病發(fā)病機(jī)制研究

根據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布的糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，糖尿病共分為4個(gè)類型，其中1型(T1DM)和2型(T2DM)是最重要也是最常見的類型。T1DM是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、器官特異性的自身免疫性疾病，免疫攻擊導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的破壞和胰島素分泌不足[2]，病因主要包括自身免疫缺陷，如谷氨酸脫羧酶抗體(GAD抗體)、胰島細(xì)胞抗體(ICA抗體)等出現(xiàn)異常，遺傳因素，病毒感染等，甚至和某些不良的生活習(xí)慣及環(huán)境因素有關(guān)。目前，臨床上多采用補(bǔ)充外源性胰島素的方法治療T1DM，但無法達(dá)到治愈效果。T2DM的發(fā)病機(jī)制主要包括胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能受損。發(fā)病早期胰島素抵抗導(dǎo)致胰島β細(xì)胞大量分泌胰島素，當(dāng)持續(xù)高血糖的葡萄糖毒性損傷胰島β細(xì)胞后，細(xì)胞分泌功能受損，胰島素水平下降，形成惡性循環(huán)。但由于胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能的異常，單獨(dú)通過控制血糖，減少葡萄糖毒性后β細(xì)胞功能及胰島素敏感性也無法完全恢復(fù)。T2DM中胰島β細(xì)胞功能、胰島素抵抗、脂代謝紊亂與葡萄糖毒性關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜[3]，甚至全身多器官組織參與T2DM的發(fā)生及發(fā)展。

2 糖尿病的干細(xì)胞研究

干細(xì)胞是具有自我更新能力及多向分化潛力的一類細(xì)胞，根據(jù)其來源一般可以分為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。其中間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是起源于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。

2001年，Assady等[4]報(bào)道了利用胚胎干細(xì)胞成功分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞(insulin-producing cells， IPCs)，盡管當(dāng)時(shí)分化細(xì)胞的比例及分泌的胰島素量不高，但第1次證實(shí)了干細(xì)胞可作為胰島β細(xì)胞的潛在來源。MSCs相較胚胎干細(xì)胞而言更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兺ǔ２恍纬苫チ觯覠o胚胎干細(xì)胞經(jīng)常涉及的倫理學(xué)問題。目前，已有文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道MSCs在體外一定條件下可定向誘導(dǎo)分化成產(chǎn)胰島素細(xì)胞，甚至可分化出胰島結(jié)構(gòu)，且MSCs強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能能有效避免特異性免疫反應(yīng)，因此干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為產(chǎn)胰島素細(xì)胞進(jìn)而移植體內(nèi)是治愈T1DM十分理想的方法。另外，MSCs的表面抗原不明顯，故異體移植排異較輕，配型要求不嚴(yán)格。MSCs的優(yōu)良特性為MSCs治療糖尿病提供了理論依據(jù)。加上MSCs組織取材方便，分離純化簡(jiǎn)單，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞相關(guān)特性，并且隨著細(xì)胞純化技術(shù)的進(jìn)步，使得從組織中獲取大量高純度、高活力的MSCs成為可能，這大大提高了治療的可行性，因此成為近年來的研究熱點(diǎn)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells， BM-MSCs)是此類研究最常用的細(xì)胞類型。BM-MSCs是取材最方便和來源最豐富的干細(xì)胞，因此大量用于體外誘導(dǎo)產(chǎn)胰島素細(xì)胞，此外，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells， UC-MSCs)、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells， UCB-MSCs)及脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells， AD-MSCs)也常用于誘導(dǎo)分化IPCs治療糖尿病。

隨著研究日漸深入，大量研究表明MSCs分化為IPCs能夠治療糖尿病，不僅僅是因?yàn)樵黾油庠葱援a(chǎn)胰島素細(xì)胞而導(dǎo)致的胰島素分泌量增加，許多研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子在改善受體胰島修復(fù)中發(fā)揮著非常重要的作用，其中較為重要的有SDF-1、VEGF、IGF-1、EGF、KGF、Ang-1、MIP-1α、MIP-1β、EPO、MMP-9等，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)血管生成和組織再生。另一方面，T1DM的胰島炎可能刺激的MSCs分泌TNF-α、TSG-6、STC-1、SDF-1、IL-6、IL-8，抑制過度的免疫應(yīng)答、抗胰島細(xì)胞凋亡和保護(hù)受傷組織免受炎癥。另外，干細(xì)胞直接的T細(xì)胞抑制，以及免疫耐受誘導(dǎo)的TGF-β和PGE2，也可能有助于干細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用。據(jù)此，許多學(xué)者認(rèn)為MSCs可能是治愈糖尿病的有效手段。

T2DM因其發(fā)病機(jī)制迥異于T1DM，干細(xì)胞治療T2DM的有效性尚未完全認(rèn)證，但已有研究[7-8]認(rèn)為T2DM發(fā)病的中心環(huán)節(jié)不是單獨(dú)的胰島素抵抗，而是胰島特別是胰島β細(xì)胞的功能異常，因此，干細(xì)胞治療T2DM依然是切實(shí)可行的。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

不同類型的MSCs需要不同的誘導(dǎo)方案及誘導(dǎo)培養(yǎng)基。此類文獻(xiàn)甚多，誘導(dǎo)方案不同，誘導(dǎo)周期也從幾天至幾十天不等，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但許多小分子化合物已經(jīng)被證實(shí)在MSCs的誘導(dǎo)分化中起重要作用，可以把它們稱之為胰島素刺激因子，包括EGF、bFGF、activin A、β-cellulin、nicotinamide、exendin-4、HGF、pentagastrin等。其中，EGF在細(xì)胞增殖、分化、存活中都起著重要作用，bFGF則增加細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞遷移，參與體內(nèi)的新生血管形成，是胰腺的細(xì)胞簇形成最有效趨化因子。高濃度EGF及bFGF無論是單獨(dú)或組合使用，均能促進(jìn)IPCs簇的形成。β-cellulin通過刺激未分化胰腺上皮細(xì)胞的有絲分裂，增加胰島細(xì)胞簇的數(shù)量。activin A能夠增加細(xì)胞胰島素合成量。尼克酰胺能保持胰島細(xì)胞活力和功能，通過其主要的代謝產(chǎn)物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)起作用。exendin- 4能夠刺激β細(xì)胞的增殖和新生，促進(jìn)不同組織起源的干細(xì)胞分化為IPCs[9]。HGF能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞形態(tài)變化，并能增加體外培養(yǎng)人胰島細(xì)胞的數(shù)量。

葡萄糖的濃度在IPCs分化中起重要作用，葡萄糖濃度較低時(shí)可增加胰島簇的胰島素分泌量，濃度較高時(shí)則能促進(jìn)β細(xì)胞的增殖，因此，在誘導(dǎo)過程中常常需要改變葡萄糖的濃度來促進(jìn)細(xì)胞的增殖，增加胰島素分泌。同樣，血清的撤退有利于細(xì)胞分化形成胰島樣簇。因此，在誘導(dǎo)的早期通常是無血清階段。

MSCs在受胰島素刺激因子誘導(dǎo)后，開始表達(dá)胰腺及胰島發(fā)育相關(guān)基因，如GLUT-2、萄糖激酶、胰島淀粉樣多肽、巢蛋白、Pdx-1、Pax-6，并合成C-肽和胰島素，這些已經(jīng)被證明在胰腺和/或胰島分化成胰島β細(xì)胞的過程中發(fā)揮作用。盡管上述胰島β細(xì)胞的分化中的轉(zhuǎn)錄因子已被發(fā)現(xiàn)，但是關(guān)于它們的功能及具體分子機(jī)制尚未可知，且大部分胰島素刺激因子在胰島β細(xì)胞的分化中是順序及瞬時(shí)表達(dá)，這要求在體外環(huán)境下MSCs誘導(dǎo)分化IPCs的過程應(yīng)該至少遵循其中主要的轉(zhuǎn)錄過程。

盡管誘導(dǎo)機(jī)制尚未完全闡明，許多研究者通過不同的誘導(dǎo)分案分別將BM-MSCs[10-11]、UCB-MSCs[12-13]、AD-MSCs[14-15]、UC-MSCs[16]成功誘導(dǎo)為IPCs，形成類似胰島的集落，并證實(shí)可對(duì)葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生胰島素。

4 糖尿病小鼠模型及動(dòng)物試驗(yàn)

在MSCs進(jìn)入人體應(yīng)用之前，動(dòng)物試驗(yàn)的數(shù)據(jù)及分析是必不可少的。大多數(shù)學(xué)者所選用的糖尿病小鼠模型主要分為兩種： (1)NOD/SCID小鼠；(2) 鏈 脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)注射法造模。NOD/SCID小鼠是T和B淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺乏具有免疫缺陷的T1DM小鼠，發(fā)病具有顯著的性別差異，飼養(yǎng)30周的雌鼠發(fā)病率可達(dá)90%～100%。STZ能夠選擇性破壞小鼠及大鼠的胰島β細(xì)胞，誘發(fā)糖尿病，大劑量注射時(shí)，可引起胰島β細(xì)胞的廣泛性破壞，造成類似T1DM的動(dòng)物模型；而注射小劑量STZ時(shí)，由于只是破壞一部分胰島β細(xì)胞的功能，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，同時(shí)給予高脂高熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出接近于人類T2DM的動(dòng)物模型。有研究者用源于UCB-MSCs[17]、UC-MSCs[18]、AD-MSCs[19-21]及BM-MSCs[22-23]單獨(dú)或者聯(lián)合造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells， HSCs)的IPCs移植治療糖尿病小鼠，試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞，小鼠血糖明顯下降，胰島素表達(dá)量增加，胰島及周圍血管再生增加，器官組織切片染色發(fā)現(xiàn)移植區(qū)出現(xiàn)胰島類團(tuán)簇，胰島素染色陽性。

5 MSCs及IPCs在人體的應(yīng)用

2008年，Trivedi等[24]報(bào)道了將AD-MSCs體外誘導(dǎo)分化為IPCs并聯(lián)合造血干細(xì)胞移植到5名糖尿病患者的門靜脈內(nèi)，因肝臟是最易發(fā)生免疫耐受的器官。結(jié)果表明所有患者可降低30%～50%的胰島素需要量，血清C肽水平提高4～26倍，并且在平均2.9個(gè)月的隨訪期內(nèi)所有患者未發(fā)生任何不良反應(yīng)，也未采取任何免疫抑制治療。2010年，Vanikar等[25]公布了AD-MSCs誘導(dǎo)IPCs聯(lián)合造血干細(xì)胞移植治療11名糖尿病患者的研究結(jié)果。報(bào)告顯示體外分化的IPCs可以分泌產(chǎn)生胰腺和(或)胰島相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Pax6、Isl1、Pdx1等，聯(lián)合造血干細(xì)胞移植患者體內(nèi)后隨訪。在平均23個(gè)月的隨訪期內(nèi)，患者表現(xiàn)出胰島素依賴量下降，糖化血紅蛋白下降，血清C肽量明顯提高，無1例患者出現(xiàn)糖尿病酮癥酸中毒，且未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，患者飲食恢復(fù)至正常。后有研究者陸續(xù)采用MSCs及IPCs治療糖尿病患者，效果較為滿意，但由于社會(huì)倫理及其他方面的限制，MSCs的治療始終無法大規(guī)模采用，臨床樣本不足。

6 展 望

綜上來看，干細(xì)胞移植似乎是目前治療糖尿病的理想方法。但是，由于MSCs定向誘導(dǎo)分化機(jī)制的尚未完全闡明，T1DM及T2DM發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜多樣，目前的研究雖然取得一定的進(jìn)展，待解決的問題仍然很多，MSCs定向分化機(jī)制尚未闡明，如何提高誘導(dǎo)效率也是當(dāng)下的難題，與治療相關(guān)的細(xì)胞移植數(shù)量、時(shí)間及途徑也沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，體內(nèi)可控性和安全性尚需要進(jìn)一步探討。

最后，如何提高M(jìn)SCs及IPCs移植體內(nèi)后的存活率也是待解決的重要課題之一。當(dāng)然，隨著細(xì)胞基因工程的迅速發(fā)展，一些新的思路也運(yùn)用到干細(xì)胞治療中，將某些促進(jìn)血管新生的基因?qū)敫杉?xì)胞內(nèi)使其過表達(dá)，不僅有助于MSCs及IPCs在體內(nèi)的定植及存活，而且有助于受體胰島的血管修復(fù)及胰島再生。

相信隨著研究的深入進(jìn)展，新技術(shù)、新方法的合理應(yīng)用，MSCs必將在糖尿病的治療中占據(jù)一席之地。

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Research Progress on Mesenchymal Stem Cells Transplantation for Treatment of Diabetes Mellitus

XUCheng-lei,SONGZhen-shun

(Dept. of Hepatopancreatobiliary Surgery, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Diabetes mellitus, especially type 1 diabetes mellitus (T1DM), is largely related to an innate defect in the immune system, resulting in the destruction of islet β cells and insulin inadequate secretion due to autoimmune attack. There is no effective method to cure diabetes at present. Mesenchymal stem cells (MSCs) have powerful capabilities of proliferation and differentiation, and offer a promising possibility for novel therapy. MSCs’ potential of transdifferentiation into insulin-secreting cells (IPCs)invitroshow us a stimulating inspiration. This review introduce a new approach of MSCs-derived IPCs, as a potential therapeutic benefit for T1DM in experimental animal models as well as in human studies.

mesenchymal stem cells; diabetes mellitus; differentiation; insulin-producing cells

10.16118/j.1008-0392.2016.05.027

2015-05-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170436)

徐承雷(1990—)，男，碩士研究生.E-mail： a402101086@163.com

宋振順.E-mail： zs_song@hotmail.com

R 587.1

A

1008-0392(2016)05-0128-05