白念珠菌定植和腸源性感染模型研究進(jìn)展

朱芳 何麗娟 黃鑫 安毛毛 姜遠(yuǎn)英,

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院，上海 200072；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

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·綜述·

白念珠菌定植和腸源性感染模型研究進(jìn)展

朱芳1何麗娟2黃鑫1安毛毛1姜遠(yuǎn)英1,2

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院，上海 200072；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

腸道共生白念珠菌是人體感染白念珠菌的重要來源。白念珠菌口胃接種到藥物處理的成年小鼠，造成白念珠菌胃腸道定植和腸源性感染。此模型可以更加貼切地模擬白念珠菌人體胃腸道大量定植和腸源性感染。該文總結(jié)2000年以來白念珠菌定植和感染成年小鼠相關(guān)國內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)白念珠菌胃腸道定植和腸源性感染模型新進(jìn)展作一綜述。

白念珠菌；定植；侵襲性感染

[Chin J Mycol，2016，11(2):125-128]

白念珠菌為條件致病菌，定植于30%～70%健康人的皮膚，生殖道黏膜和胃腸道黏膜[1]。隨著臨床侵襲性治療手段的發(fā)展和廣譜抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等長期大量應(yīng)用，白念珠菌可趁機(jī)大量繁殖，戰(zhàn)勝人體固有免疫防線，侵襲入口腔、胃腸道及陰道黏膜，進(jìn)而播散至血液或其他組織器官中，造成侵襲性感染。人體腸道定植白念珠菌被認(rèn)為腸源性念珠菌感染的重要途徑[2]。研究者對(duì)念珠菌定植和感染成年小鼠模型做了大量研究,主要?dú)w類為白念珠菌胃腸道定植、食管胃腸道感染和腸源性系統(tǒng)感染?，F(xiàn)主要就2000年以來成年小鼠胃腸道定植和感染白念珠菌模型國內(nèi)外相關(guān)研究成果進(jìn)行總結(jié)，以期為白念珠菌動(dòng)物感染試驗(yàn)提供參考。

1 白念珠菌胃腸道定植小鼠模型

小鼠腸道內(nèi)共生大量菌群。它們相互制約，維持腸道微生態(tài)平衡。白念珠菌非小鼠內(nèi)源性真菌[3]。以糞便載菌量考察白念珠菌胃腸道定植，發(fā)現(xiàn)定植很快消失[4-7]。Yordanov M等[4]給小鼠口胃接種白念珠菌后，第5天檢測小鼠糞便載菌量<2×102CFU/g。研究者使用抗菌藥物打破腸道菌群平衡，發(fā)現(xiàn)白念珠菌定植 (以研究時(shí)間計(jì)，定植多為2～3周，較長時(shí)間為80 d以上)[5-11]。Sarah等[5]給予小鼠飲用含抗菌藥物 (四環(huán)素1 mg/mL、鏈霉素2 mg/mL和慶大霉素0.1 mg/mL)的溶液，4 d后灌胃給予白念珠菌，試驗(yàn)全程給予抗菌藥物溶液。如接種白念珠菌DAY185，5×107CFU/只，第21天時(shí)，發(fā)現(xiàn)鼠便載菌量為4～5 log10 CFU/g。給予胃腸道黏膜異常小鼠抗菌藥物治療并口胃接種白念珠菌，亦造成小鼠白念珠菌定植。Takahashi等[12]先予小鼠蛋白營養(yǎng)不良飲食，造成小鼠消化道道黏膜異常 (如小腸絨毛短，直腸上皮細(xì)胞層變短、薄、無規(guī)律，食管角蛋白層變薄等)。灌胃給菌 (1.5×108CFU/只)后，小鼠飲用含鏈霉素溶液 (0.25 mg/mL)至試驗(yàn)結(jié)束。第7天蛋白營養(yǎng)不良組小鼠便載菌量是蛋白營養(yǎng)豐富組量的10倍左右。蛋白營養(yǎng)不良性小鼠白念珠菌接種后3個(gè)月，小鼠便載菌量6～7 log10 CFU/g，營養(yǎng)豐富的小鼠第35天檢測不到小鼠便菌量。

2 白念珠菌食管胃腸道感染小鼠模型

SCID小鼠為免疫缺陷小鼠，24 h自由飲用含白念珠菌的混懸液 (5×107CFU/mL)，可以模擬AIDS患者出現(xiàn)的黏膜念珠菌病 (黏膜出現(xiàn)嚴(yán)重念珠菌感染，很少發(fā)生系統(tǒng)性感染)[13-14]。同樣，口胃接種白念珠菌，IL-12基因敲除小鼠易發(fā)生口腔白念珠菌感染，未發(fā)生系統(tǒng)性感染[15]。自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞缺陷無菌小鼠 (Tgε26)自由飲用含白念珠菌的混懸液 (106CFU/mL)后的3～5周內(nèi)，小鼠口腔食管和胃感染使小鼠致死，但不引起系統(tǒng)性念珠菌感染[16-17]。無菌小鼠C57BL/6和BALB/c，易感胃部真菌??；口胃接種白念珠菌后，白念珠菌能夠快速定植 (口腔接種1 d后)和慢性定植 (研究期為4周)，未見內(nèi)部臟器侵襲性感染[18]。

3 白念珠菌腸源性系統(tǒng)感染小鼠模型

研究顯示用抗菌藥物聯(lián)合口胃接種白念珠菌處理小鼠，不僅導(dǎo)致白念珠菌的胃腸道定植，還可致白念珠菌向內(nèi)臟侵襲[4,19]。Yordanov M等[4]給予小鼠飲用含阿莫西林 (1 mg/mL)和阿米卡星 (0.1 mg/mL)溶液7 d后，灌胃給予白念珠菌 (1×108CFU/只)，于第15天檢測出腎臟載菌量 (4.3±0.8 log10 CFU/g)。

大劑量使用免疫抑制劑，可導(dǎo)致免疫低下和胃腸道黏膜的破壞，白念珠菌和細(xì)菌 (如革蘭陰性菌)等可乘機(jī)穿過破損的黏膜，造成感染?？咕幬锏膽?yīng)用不僅減少了內(nèi)源性菌群，同時(shí)可以一定程度上避免小鼠死亡于細(xì)菌感染[19-20]。免疫抑制劑聯(lián)合非全程抗菌藥物治療，接種后的短暫時(shí)間內(nèi)可以檢測到臟器白念珠菌侵襲和長時(shí)間的定植[21]。全程給予免疫抑制劑和抗菌藥物治療的動(dòng)物接種白念珠菌，可以導(dǎo)致白念珠菌播散性感染[11,19]。Karl V Clemons等[19]發(fā)現(xiàn)提前3 d給予5-氟尿嘧啶 (200 mg/kg)、慶大霉素 (0.2 mg/mL)、克林霉素 (1 mg/mL)和萬古霉素 (1 mg/mL)；皮下給予亞胺培南西司他丁5 mg，第4天小鼠飲用含白念珠菌的混懸液 (5×107CFU/mL)感染 (記為第0天)后，以后每7 d免疫抑制1次，繼續(xù)抗菌藥物治療，并將亞胺培南西司他丁改為腹腔注射。5～15 d全部小鼠肝臟檢測出白念珠菌，腎臟較少感染。數(shù)據(jù)顯示，免疫抑制同時(shí)添加抗菌藥物小鼠組織載菌量較未給抗菌藥物高。

免疫抑制聯(lián)合胃腸道黏膜異常，可模擬白念珠菌血液播散。Takahashi等[12]研究發(fā)現(xiàn)蛋白營養(yǎng)不良飲食造成小鼠腸道黏膜異常，合并抗菌藥物處理，可以導(dǎo)致白念珠菌的長期定植；在定植的基礎(chǔ)上，感染后第4天開始腹腔注射給予甲氨蝶呤 (150 mg/kg)和環(huán)磷酰胺 (150 mg/kg)，以后4 d每天腹腔注射環(huán)磷酰胺 (150 mg/kg)，可以造成小鼠白念珠菌血液播散病。在第7～8天肝臟首先檢測出白念珠菌，之后在血液中檢測到白念珠菌。

在白念珠菌小鼠腸源性感染的模型中，研究者多采用免疫抑制與抗菌藥物等的聯(lián)合應(yīng)用[11-12,19-22]。Andrew等[20]在探究構(gòu)成白念珠菌播散性感染相關(guān)條件時(shí)，構(gòu)建了白念珠菌定植和感染模型。具體如下：連續(xù)3 d小鼠飲用含鏈霉素 (2 mg/mL)、青霉素G (1 500 U G/mL)和氟康唑 (0.25 mg/mL)溶液，第4天飲用除氟康唑外的上述溶液，第5天起連續(xù)5 d飲用含白念珠菌 (1×107CFU/mL)和鏈霉素、青霉素混懸液。接著給予免疫抑制劑 (如環(huán)磷酰胺每隔1 d腹腔注射150 mg/kg，共3次等免疫方案)，此時(shí)另加慶大霉素 (0.2 mg/mL)，并繼續(xù)給予鏈霉素和青霉素G。最近研究者[7-12,23]調(diào)整了Andrew等的白念珠菌定植和感染模型，進(jìn)行相關(guān)研究。如Simon Vautier等[7]在探究Dectin-1在白念珠菌胃腸道定植的作用時(shí)，不再給予免疫抑制劑；將青霉素由1 500 U/mL調(diào)至2 000 U/mL，其他試劑配置劑量不變，抗菌藥物給藥途徑、過程不變。

4 模型的評(píng)估

在評(píng)估模型時(shí)，要把握“定植”“感染”的特點(diǎn)。白念珠菌共生機(jī)體內(nèi)，攜帶者無癥狀[15]。在小鼠白念珠菌定植模型中，一般小鼠無死亡；觀察期間有較大量的鼠便載菌量和腸道組織載菌量[7-12]；有低量的腎載菌量[7,9]。在食管胃腸道感染模型中，小鼠肝臟、腎臟和脾臟無念珠菌感染，黏膜念珠菌侵襲，病理檢查發(fā)現(xiàn)胃腸道組織內(nèi)存在菌絲等[15-16]。在腸源性播散性感染的模型中，小鼠可出現(xiàn)死亡或垂死 (昏睡，眩暈，體重下降和鼠毛干燥褶皺)；肝首先出現(xiàn)較高的載菌[12,24]，伴隨較高的腸道載菌量或者在檢查的臟器中 (腸、腎臟、肝臟和脾臟)至少有3個(gè)臟器以上有較高的載菌量 (>1.5 log10 CFU/g)[11]。

5 討 論

機(jī)械屏障、微生物屏障、免疫屏障和化學(xué)屏障共同組成機(jī)體黏膜屏障[25]，在防御病原侵襲中發(fā)揮著重要的作用。研究認(rèn)為腸道黏膜損傷、腸道菌群失衡和宿主免疫防護(hù)缺陷等三因素促進(jìn)白念珠菌感染[26]。Yamaguchi N等[27]以營養(yǎng)豐富的純化飼料 ( AIN-93G)飼養(yǎng)小鼠，單次口胃接種白念珠菌導(dǎo)致小鼠胃部念珠菌病。研究顯示其胃部有機(jī)酸濃度和乳酸桿菌數(shù)量較商用飼料低，認(rèn)為乳酸桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)白念珠菌的抑制作用影響了它胃腸道定植。另外，研究發(fā)現(xiàn)膽汁能顯著降低白念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性等[28-29]?？梢?，化學(xué)屏障 (胃酸、膽汁、各種消化酶等等)在后期的研究中應(yīng)該得到重視。

在免疫正常時(shí)，小鼠口胃接種白念珠菌，少量白念珠菌進(jìn)入肝臟，可能是白念通過門靜脈循環(huán)或者膽道進(jìn)入[20]。在腸源性念珠菌感染模型中，肝臟感染很常見[19-20]。白念珠菌主要定植在胃黏膜的賁門附近[12,21,27,30]。研究發(fā)現(xiàn)胃部載菌量高，上部小腸菌量最低，而順著腸道向下，菌量遞增[3]。盲腸內(nèi)容物中可見酵母態(tài)和菌絲態(tài)白念珠菌[3-4]。

白念珠菌同一菌株在不同品系小鼠定植能力不同[7,26]，表達(dá)不同的細(xì)胞因子[18]，如無菌動(dòng)物C57BL/6和BALB/c小鼠胃部感染念珠病，表達(dá)不同量趨化因子、細(xì)胞因子和β-防護(hù)素。不同的白念珠菌菌株黏膜定植能力不同，播散能力也不同。白念珠菌定植時(shí)根據(jù)機(jī)體不同微環(huán)境表達(dá)不同的基因，進(jìn)行自我調(diào)節(jié)[5]。很多研究者選用SC5314為工具菌進(jìn)行體內(nèi)研究，SC5314不能很好地定植黏膜表面[31]。為避免菌株自身的局限性，研究提示最好使用多株白念珠菌，應(yīng)包括臨床分離菌株[23,25]。研究提示應(yīng)關(guān)注實(shí)驗(yàn)操作等：抗菌藥物處理的小鼠易感宿主 (小鼠)-宿主 (小鼠)的真菌傳播[8]，其媒介可能是操作用手套，小鼠定位器和換籠時(shí)的糞便污染等等。

6 展 望

盡管與尾靜脈注射白念珠菌混懸液模擬播散性感染模型相比，本模型需要控制條件更多，實(shí)驗(yàn)周期更長；但它更接近臨床發(fā)病過程，更能啟發(fā)新思路。最近研究[23]以成年小鼠可以抵抗白念珠菌的定植為啟發(fā)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)共生厭氧菌在抵制白念珠菌定植中起到重要作用，如多形擬桿菌激活HIF-1α (激活先天免疫反應(yīng)的重要因子)和LL-37 (抗微生物肽)，調(diào)節(jié)直腸免疫反應(yīng)，從而抑制白念珠菌的定植。研究者認(rèn)為通過影響腸道黏膜免疫因素，調(diào)節(jié)白念珠菌的定植，從而為預(yù)防念珠菌侵襲性感染找到新的策略。另外，在探討主要宿主免疫反應(yīng)、研究基因修飾菌株毒力因子、評(píng)價(jià) (藥物或疫苗)藥效和白念珠菌感染的診斷方法等也發(fā)揮重要作用，而兩種不同給菌方式復(fù)制的感染模型的結(jié)合，進(jìn)一步發(fā)揮它們積極的作用。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

The research progress onCandidaalbicanscolonization and infection in the mice gastrointestinal tract

ZHU Fang1,HE Li-juan2,HUANG Xin1,AN Mao-mao1,JIANG Yuan-ying1,2

(1.ShanghaiTenthPeople’sHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200072,China;2SchoolofPharmacy,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Candidaalbicanswas regarded as a commensal within the gut in humans and the gut had been considered as an important site forCandidaalbicansinvasive infection.Antibiotic(s)-treated mice orally givenCandidaalbicanscould closely mimic the clinical manifestations,including gastrointestinal colonization and invasive infection.Immunosuppressants were required for the worse invasive infection.There we summarized the progress on the models ofCandidaalbicanscolonization and/or invasive infection in the gastrointestinal tract from related literatures since 2000.

Candidaalbicans;colonization;invasive infection

國家自然科學(xué)基金 (81330083)，科技部新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng) (2012ZX09103101-003)

朱芳，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:fzhu2013@163.com

姜遠(yuǎn)英，E-mail:jiangyy@#edu.cn;安毛毛，E-mail:anmaomao@#edu.cn

R 519.3

A

1673-3827(2016)11-0125-04

2015-07-24