過(guò)表達(dá)鋅指蛋白A20可抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)

朱曉丹， 王 穎， 畢 晶， 童 琳， 劉 潔， 宋元林， 白春學(xué)

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

ZHU Xiao-dan, WANG Ying, BI Jing, TONG Lin, LIU Jie, SONG Yuan-lin, BAI Chun-xue*

Department of Respiratory Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

論 著

過(guò)表達(dá)鋅指蛋白A20可抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)

朱曉丹， 王 穎， 畢 晶， 童 琳， 劉 潔， 宋元林， 白春學(xué)*

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

目的：通過(guò)建立A20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞株，研究A20對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及調(diào)控機(jī)制。方法：構(gòu)建攜帶A20基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)，篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)A20基因的細(xì)胞株并行體外培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中加入脂多糖(LPS, 1 μg/mL)進(jìn)行干預(yù)，并于刺激后0.5、1、2、4 h收集上清液及細(xì)胞。ELISA法測(cè)定上清液中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)及核因子κB(NF-κB)活性。Western 印跡方法檢測(cè)A20蛋白及核內(nèi)p65含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定A20 mRNA含量。結(jié)果：LPS刺激后，A20過(guò)表達(dá)組(A20組)及正常對(duì)照組(VEC組)A20蛋白及mRNA含量都升高，并于1 h達(dá)高峰，之后逐漸下降；且A20組較VEC組A20水平明顯升高(P<0.05)。與VEC組相比，A20組培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)水平明顯降低(P<0.05)；NF-κB DNA結(jié)合活性及核內(nèi)p65含量也降低(P<0.05)。結(jié)論：A20能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB活性及TNF-α、IL-1β分泌，進(jìn)而抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)活性。

急性呼吸窘迫綜合征；A20蛋白；肺泡；巨噬細(xì)胞；炎癥反應(yīng)

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是造成重癥肺炎、重癥急性呼吸綜合征(SARS)、爆發(fā)性禽流感等疾病患者死亡的主要原因。ARDS病死率高，在美國(guó)，其死亡人數(shù)相當(dāng)于每年因乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌死亡的人數(shù)總和[1]。其誘因主要為肺部感染和全身性感染。其中在脂多糖(LPS)導(dǎo)致的ARDS中，促炎及抗炎反應(yīng)失衡是根本原因。肺泡巨噬細(xì)胞在其中起始動(dòng)作用，并與核因子(NF-κB)炎癥信號(hào)通路過(guò)度反應(yīng)密切相關(guān)[2-3]。

A20蛋白，又稱(chēng)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)，是一種泛素修飾酶[4]。既往研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，A20基因多態(tài)性與多種炎癥性疾病有關(guān)，并可負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB。在呼吸系統(tǒng)中A20基因SNP位點(diǎn)(rs4755453)與急性肺損傷的易感性有關(guān)[9]。A20基因敲除小鼠能產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并在TNF-α及LPS干預(yù)之后更明顯，提示A20能夠抑制機(jī)體腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的NF-κB活化[10]。NF-κB在肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中具有重要作用，而A20能夠調(diào)控NF-κB活化。因此本研究主要探討A20蛋白對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥活性的影響。

1 材料與方法

1.1 肺泡巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng) 選取NR8383大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，采用含20%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基(Sigma，貨號(hào)：N3520)，添加NaHCO32.5 g/L、1% P/S (100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)、2 mol/LL-谷氨酰胺溶液，置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 A20質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用RT-PCR法(按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，上游引物：5′-GTT GGC AAA GCA TAC AAC TGA AAG G-3′；下游引物：5′-GGC TGT GAC GAA GGA AGA GCT TA-3′)擴(kuò)增小鼠A20 cDNA(購(gòu)于康為世紀(jì))。在EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)將上述cDNA插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。按照LipofectamineTM2000 (Invitrogen，11 668-019)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)將上述含有A20目的基因的載體轉(zhuǎn)染NR 8383肺泡巨噬細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western 印跡法檢測(cè)細(xì)胞中A20基因和蛋白的表達(dá)。

1.3 LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞 將體外培養(yǎng)慢病毒包裝后的肺泡巨噬細(xì)胞株分為A20過(guò)表達(dá)組(A20組)和過(guò)表達(dá)空載組(VEC組)。向培養(yǎng)基中加入LPS(1 μg/mL)進(jìn)行刺激，分別于刺激后0.5、1、2、4 h，將培養(yǎng)液離心，吸取上清液，并收獲細(xì)胞。細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白及總RNA，采用Western 印跡法檢測(cè)A20、NF-κB蛋白表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中A20 mRNA表達(dá)情況(A20引物，上游引物：5′- GCA GTG TAA AAG GCA GGC TAA C-3′，下游引物：5′-TGG GGT TCT CTC TCG TAT CTT C-3′；β-actin引物上游引物：5′-GGA GATT AGT GCC CTG GCT CCT A-3′，下游引物：5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′)。

1.4 NF-κB活性及細(xì)胞因子檢測(cè) 用非放射性NF-κB p65轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)試劑盒(Active Motif)檢測(cè)上清液中NF-κB活性；ELISA試劑盒(R&D)檢測(cè)上清液TNF-α、IL-1β水平。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察A20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞 將攜帶A20基因的病毒載體轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞(A20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞)，感染24 h后，可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下觀察A20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞

A：明視野；B：熒光視野.Original magnification: ×200

2.2 A20過(guò)表達(dá)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的A20表達(dá)鑒定 采用Western 印跡及實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定A20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞中A20的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，A20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞(A20)中A20蛋白及mRNA含量較VEC組明顯升高，可用于后續(xù)研究(圖2)。

圖2 A20過(guò)表達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞中A20表達(dá)情況

2.3 LPS刺激后大鼠肺泡巨噬細(xì)胞A20表達(dá)情況 VEC組及A20組LPS刺激后A20蛋白及mRNA含量均較刺激前升高，且于1 h達(dá)高峰，之后逐漸下降；LPS刺激后A20組中A20蛋白及mRNA的含量高于VEC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.4 A20對(duì)LPS刺激后肺泡巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的影響 LPS刺激后，與0 h比較，其他各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-1β均明顯升高(圖4)；A20組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較VEC組培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平(TNF-α、IL-1β)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明A20能抑制LPS刺激后肺泡巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞因子分泌(圖4)。

圖3 各時(shí)間點(diǎn)肺泡巨噬細(xì)胞中A20蛋白及mRNA含量

圖4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α及IL-1β水平A：TNF-α水平；B：IL-1β水平.?P<0.05與0 h比較；*P<0.05與VEC組比較.n=3,

2.5 A20對(duì)LPS刺激后肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB的影響 給予LPS刺激后，與0 h比較，其他各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組核內(nèi)p65蛋白含量(圖5A、5B)及NF-κB DNA結(jié)合活性(圖5C)升高；與VEC組相比，A20組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)核內(nèi)p65蛋白含量(圖5A、5B)及NF-κB DNA結(jié)合活性(圖5C)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明A20能抑制肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB表達(dá)及活性。

3 討 論

過(guò)度放大的炎癥反應(yīng)是ARDS重要的病理生理特征，而肺泡巨噬細(xì)胞在其中起始動(dòng)作用。通常認(rèn)為，ARDS具有雙期炎癥過(guò)程，晚期依賴于中性粒細(xì)胞，早期肺泡巨噬細(xì)胞為啟動(dòng)ARDS炎癥瀑布發(fā)揮著巨大作用[11]。當(dāng)外界刺激因子作用于機(jī)體時(shí)，首先激活巨噬細(xì)胞，釋放并活化一系列促炎因子，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8等，進(jìn)而作用于各種效應(yīng)細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過(guò)度放大及失衡，最終造成ARDS。此外，肺巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，因不能被血清滅活，而在肺內(nèi)不斷蓄積，使始動(dòng)因素持續(xù)存在，造成ARDS繼續(xù)。在LPS所致的ARDS中，LPS能夠?qū)е路闻菥奘杉?xì)胞中NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路過(guò)度反應(yīng)，誘導(dǎo)上述細(xì)胞因子活化，進(jìn)而造成肺損傷。因此，有效地抑制肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB活性可能是延緩或抑制ARDS炎癥反應(yīng)行之有效的方法。

圖5 LPS干預(yù)后肺泡巨噬細(xì)胞中A20、NF-κB蛋白表達(dá)及活性變化

A20是相對(duì)分子質(zhì)量約80 000的胞內(nèi)鋅指蛋白，最早在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。目前，它被認(rèn)為是重要的炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)因子。多種炎癥因子刺激，如LPS、IL-1β及CD40等，能夠誘導(dǎo)A20表達(dá)。本研究中，體外LPS刺激大鼠肺泡巨噬細(xì)胞后，A20表達(dá)增加，這與以往的研究[5]相似。本研究發(fā)現(xiàn)，A20表達(dá)高峰期在LPS刺激后1 h，與IL-1β及TNF-α的分泌時(shí)相一致，提示A20與肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，LPS刺激后該細(xì)胞株中A20蛋白及mRNA含量較VEC組明顯升高，而IL-1β及TNF-α水平明顯降低，表明A20能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-1β及TNF-α。研究[11-12]認(rèn)為，IL-1β及TNF-α是與ARDS有關(guān)的主要近端細(xì)胞因子，在ARDS早期主要由巨噬細(xì)胞分泌，并通過(guò)刺激肺部的各種效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生遠(yuǎn)端細(xì)胞因子，起動(dòng)細(xì)胞因子瀑布。本研究中A20能抑制這兩種細(xì)胞因子的分泌，提示A20可能通過(guò)抑制肺泡巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-β來(lái)調(diào)控ARDS。

NF-κB在細(xì)胞因子瀑布的調(diào)節(jié)中起重要作用[13-15]。在LPS誘導(dǎo)的ARDS中，NF-κB通路是主要的炎癥信號(hào)通路之一，它能夠調(diào)節(jié)多種促炎因子的表達(dá)及分泌，如TNF-α、IL-β、IL-6等。NF-κB的結(jié)合序列在巨噬細(xì)胞來(lái)源的很多細(xì)胞因子(包括TNF-α、IL-1β，IL-6和IL-8)啟動(dòng)子中被發(fā)現(xiàn)。既往研究[4]發(fā)現(xiàn)，A20能夠抑制NF-κB活化及TNF-α和IL-1誘導(dǎo)的信號(hào)通路傳導(dǎo)。NF-κB活化過(guò)程涉及多個(gè)蛋白的泛素化，包括MALT1、TRAF6，而A20蛋白能夠脫去這些蛋白的泛素化鏈，從而調(diào)控NF-κB的活化。本研究中給予LPS刺激后，與VEC組相比，A20組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)核內(nèi)p65蛋白含量及NF-κB DNA結(jié)合活性都明顯降低，表明A20能抑制肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB表達(dá)及活性。由于NF-κB能調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β分泌，故綜合以上研究結(jié)果，A20可能通過(guò)抑制NF-κB而調(diào)控TNF-α、IL-1β分泌，進(jìn)而抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，在ARDS炎癥反應(yīng)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

A20 regulates the inflammatory responses of alveolar macrophage

Objective：To study the effects of A20 on the inflammatory response of alveolar macrophages and its regulation mechanism through establishing A20 over-expressing alveolar macrophage cell lines.Methods：Lentivirus-mediated expression vector carrying A20 gene was constructed, then it was transfected into rat alveolar macrophage cell lines (NR8383), and the cell lines which stably overexpressed A20 gene were screened and culturedinvitro.Lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL) was added into the medium to intervene, the culture supernatants and cells were collected 0.5, 1, 2, 4 hours after stimulation, ELISA method was used to determine the activity of cytokines (TNF-α, IL-1β) and nuclear factor (NF-κB).Western blotting method was used to detect A20 protein and nuclear p65 content, and real-time fluorescence quantitative PCR method was used to determine the content of A20 mRNA.Results：After LPS stimulation, the levels of A20 protein and mRNA in A20 overexpression group (A20 group) and the normal control group (VEC group) both increased and reached the peak at 1 h, and then gradually decreased.The A20 level of A20 group was significantly higher than that of VEC group (P<0.05).Compared with VEC group, the levels of cytokines (TNF-α, IL-1β) in culture supernatants of A20 group significantly reduced (P<0.05), and the DNA binding activity of NF-κB and nuclear p65 content of A20 group also significantly reduced (P<0.05).Conclusions：A20 can inhibit the activity of NF-κB and the secretion of TNF-α and IL -1β, and then inhibit the inflammatory reaction activity of alveolar macrophages, thereby reducing the inflammatory response of acute respiratory distress syndrome (ARDS).

acute respiratory distress syndrome; A20 protein; alveolar; macrophage; inflammatory response

2016-08-19[接受日期]2016-11-01

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81300055，81500025)，國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(30930090).Supported by National Natural Science Youth Foundation of China (81300055，81500025) and Key Project of National Natural Science Foundation of China (30930090).

朱曉丹，博士，住院醫(yī)師.E-mail: dan_yt@126.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64041990-2963, E-mail: bai.chunxue@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160822

R 563.8

A

ZHU Xiao-dan, WANG Ying, BI Jing, TONG Lin, LIU Jie, SONG Yuan-lin, BAI Chun-xue*

Department of Respiratory Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China