ω-3魚油脂肪乳對肝細胞氧化損傷的修復(fù)作用及其機制

李智強，楊大剛，王惠群

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004)

ω-3魚油脂肪乳對肝細胞氧化損傷的修復(fù)作用及其機制

李智強，楊大剛，王惠群

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004)

目的 觀察ω-3魚油脂肪乳對肝細胞氧化損傷的修復(fù)作用，并探討其機制。方法 體外培養(yǎng)人肝細胞系HL7702細胞。取對數(shù)生長期的HL7702細胞分成對照組、模型組和觀察組，每組9孔。對照組僅加培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；模型組、觀察組在培養(yǎng)基中加入500 μmol /L過氧化氫(H2O2)，培養(yǎng)1 h后觀察組加入0.5% ω-3魚油脂肪乳；另設(shè)空白對照組，只加培養(yǎng)基，無細胞。各組繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細胞，油紅O染色觀察各組細胞內(nèi)脂滴變化，CCK-8法測算各組細胞存活率，DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)，比色法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，COD-PAP單試劑比色法檢測各組細胞內(nèi)甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC),硫代巴比妥酸法檢測各組細胞內(nèi)丙二醛(MDA) ，黃嘌呤氧化酶法檢測各組細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)，實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)α mRNA，Western blotting法檢測各組細胞中肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)相對表達量。結(jié)果 光鏡下可見脂滴染為橘紅色。對照組組HL7702肝細胞排列緊密, 僅見少許橘紅色脂滴。模型組肝細胞可見大量橘紅色脂滴并伴有脂滴融合現(xiàn)象。觀察組肝細胞可見較多橘紅色脂滴, 但與模型組比較顯著減少。對照組、模型組、觀察組細胞存活率分別為67.25%±4.68%、71.72%±2.47%、100%。觀察組細胞存活率高于模型組(P<0.05)，但低于對照組(P<0.05)。與對照組比較，模型組細胞內(nèi)ROS增高(P<0.05),細胞培養(yǎng)上清液ALT、AST增高(P均<0.05)，細胞內(nèi)TG 、TC 、MDA增高(P均<0.05)，細胞內(nèi)SOD降低(P<0.05)，PPARα mRNA降低(P<0.05)，L-FABP相對表達量降低(P<0.05)。與模型組比較，觀察組細胞內(nèi)ROS降低(P<0.05),細胞培養(yǎng)上清液ALT、AST均降低(P均<0.05)，細胞內(nèi)TG 、TC 、MDA均降低(P均<0.05)，細胞內(nèi)SOD活性增高(P<0.05)，PPARα mRNA增高(P<0.05), L-FABP相對表達量增高(P<0.05)。結(jié)論 ω-3魚油脂肪乳可修復(fù)人肝HL7702細胞氧化損傷，其機制可能與其上調(diào)L-FABP / PPARα信號通路相關(guān)因子的表達、維持肝細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。

ω-3魚油脂肪乳；肝細胞；氧化損傷；細胞存活；過氧化物酶體增生物激活受體α；肝型脂肪酸結(jié)合蛋白

人機體內(nèi)正常情況下活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。當內(nèi)源性或外源性的刺激破壞平衡后可致活性氧大量生成。當活性氧超過機體抗氧化系統(tǒng)清除能力時,會引起細胞DNA氧化損傷及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達異常，并產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)，最終對機體造成不可逆的損傷[1，2]。肝臟細胞的氧化損傷在很多肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中普遍存在，如肝臟的缺血-再灌注損傷、梗阻性黃疸并發(fā)肝損傷、脂肪性肝病、藥物性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化等[3，4]。ω-3魚油脂肪乳含有二十碳五烯酸(EPA) 和二十二碳六烯酸(DHA)。研究表明EPA和DHA在抗炎、抗血栓、降低血脂、抗過敏等方面具有重要作用[5,6]，在人體中也具有抗氧化的功能[7]。但ω-3魚油脂肪乳的抗氧作用具體機制尚未完全明確。本研究觀察ω-3魚油脂肪乳對人肝HL7702細胞氧化損傷的修復(fù)作用，并探討其可能機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 人肝細胞系HL7702細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。H2O2溶液購自國藥公司。ω-3魚油脂肪乳注射液購自奧地利費森尤斯卡比公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所，ROS、TG、TC、MDA、SOD、ALT、AST檢則試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)公司。油紅O染液購自Solarbio公司。RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。PCR引物由上海生工生物公司合成，總RNA提取純化試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。兔抗人L-FABP單克隆抗體購自Abcam公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗和兔抗人β-actin多克隆抗體購自博士德公司。

1.2 HL7702細胞分組、氧化損傷細胞模型建立及ω-3魚油脂肪乳應(yīng)用 人肝細胞系HL7702細胞用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化將細胞濃度調(diào)整為5 × 104/mL，接種于6孔板或96孔板，細胞過夜貼壁后換液，分成對照組、模型組和觀察組，每組9孔。對照組僅加培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；模型組、觀察組在培養(yǎng)基中加入500 μmol /L過氧化氫(H2O2)，培養(yǎng)1 h后觀察組加入0.5% ω-3魚油脂肪乳。各組細胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。另設(shè)空白對照組，只加培養(yǎng)基，無細胞。

1.3 模型、觀察組組細胞存活率測算 采用CCK-8 法。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h，用酶標儀在450 nm 波長測定各孔的吸光度(OD值)，計算細胞存活率。模型組、觀察組細胞存活率(%)=(模型、觀察組OD值-空白對照組OD值) /(對照組OD 值-空白對照組OD值)×100%。

1.4 各組細胞內(nèi)脂滴觀察 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，加入油紅O染色1 h，異丙醇脫色30 s，蘇木素復(fù)染10 s，顯微鏡下(400×)觀察細胞內(nèi)的脂滴變化。

1.5 各組細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)檢測 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，按照ROS試劑盒說明書用DCFH-DA熒光探針法檢測ROS，熒光酶標儀測定熒光強度，激發(fā)波長(500±15)nm，發(fā)射波長(530±20)nm。結(jié)果用熒光強度表示。

1.6 各組細胞培養(yǎng)上清液ALT、AST檢測 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，收集培養(yǎng)液1 000 r/min 離心5 min，取上清，按照ALT、AST檢測試劑盒說明書檢測ALT、AST。

1.7 各組細胞內(nèi)TG、TC、MDA 、SOD檢測 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次,用0.25%胰蛋白酶消化后加入完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，用RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白含量，按照TG 、TC、MDA、SOD檢測試劑盒說明書上的方法計算1 mg蛋白質(zhì)所對應(yīng)的TG 、TC、MDA及SOD。

1.8 各組細胞過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)α mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細胞，按RNA提取試劑盒說明書方法提取各組細胞總RNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書擴增PPARα基因, PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃10 s，60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。PPARα引物正向：5′-CAGGCTTCGCAAACTTGGAC-3′，反向：5′-GCTACCAGCATCCCGTCTTT-3′，擴增產(chǎn)物長度為119 bp。以β-actin為內(nèi)參照,β-actin引物正向：5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反向：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，擴增產(chǎn)物長度為185 bp。以2-ΔΔCt表示PPARα mRNA相對表達量。

1.9 各組細胞肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)蛋白檢測 采用Western blotting法。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細胞提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度, 蛋白質(zhì)進行變性處理后按各組細胞的蛋白濃度加樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h, 兔抗L-FABP單克隆抗體(1∶500 稀釋)4 ℃孵育過夜, TBST洗滌3次，二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h, TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影,以β-actin作為內(nèi)參照，Quantity One軟件分析結(jié)果。以目的蛋白與內(nèi)參照灰度值的比值來表示目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞內(nèi)脂滴形態(tài)比較 光鏡下可見脂滴染為橘紅色。對照組HL7702肝細胞排列緊密, 僅見少許橘紅色脂滴。模型組肝細胞可見大量橘紅色脂滴并伴有脂滴融合現(xiàn)象。觀察組肝細胞可見較多橘紅色脂滴, 但與模型組比較顯著減少。

2.2 各組細胞存活率比較 對照組、模型組、觀察組細胞存活率分別為100%、67.25%±4.68%、71.72±2.47%。觀察組細胞存活率高于模型組(P<0.05)，但低于對照組(P<0.05)。

2.3 各組細胞內(nèi)ROS及細胞培養(yǎng)上清液ALT、AST比較 各組細胞內(nèi)ROS及細胞培養(yǎng)上清液ALT、AST見表1。

表1 各組細胞內(nèi)ROS、細胞上清液ALT和AST比較

注:與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 各組細胞TG、TC、MDA及SOD比較 各組細胞TG、TC、MDA及SOD見表2。

表2 各組細胞TG、TC、MDA及SOD比較

注:與對照組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05。

2.5 各組細胞PPARα mRNA相對表達量比較 對照組、模型組、觀察組細胞PPARα mRNA相對表達量分別為1、0.63±0.03、0.71±0.05。與對照組比較，模型組細胞PPARα mRNA相對表達量降低(P<0.05)；觀察組細胞PPARα mRNA相對表達量高于模型組(P<0.05)，但低于對照組(P<0.05)。

2.6 各組細胞L-FABP蛋白相對表達量比較 對照組、模型組、觀察組組細胞L-FABP蛋白相對表達量分別為0.87±0.03、0.65±0.03、0.76±0.02。與對照組組比較，模型組細胞L-FABP蛋白相對表達量降低(P<0.05)；觀察組細胞L-FABP蛋白相對表達量高于模型組(P<0.05)，但低于對照組(P均<0.05)。

3 討論

細胞氧化損傷由高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物引起。目前常用的體外細胞氧化損傷模型是用H2O2誘導(dǎo)氧化損傷。H2O2是重要的活性氧，極易透過細胞膜與細胞內(nèi)鐵離子反應(yīng)形成高活性自由基。本研究通過在培養(yǎng)基中加入500 μmol /L H2O2成功構(gòu)建肝細胞氧化損傷模型。

ROS是反映細胞氧化損傷程度的直接指標，MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物反映了細胞受氧自由基攻擊的損傷程度，SOD 是體內(nèi)最重要的抗氧化酶，SOD水平反映了細胞清除氧自由基的能力。ω-3魚油脂肪乳在免疫營養(yǎng)治療中具有維護機體和組織生理功能的作用。Heller等[8]研究發(fā)現(xiàn)ω-3魚油脂肪乳能減少患者住院天數(shù)及抗生素的使用量，提高臨床療效和患者的生存率。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組肝細胞存活率顯著降低，細胞內(nèi)脂滴增多，ROS和MDA水平升高，細胞培養(yǎng)上清液ALT、AST升高，細胞內(nèi)SOD水平降低。表明模型組肝細胞出現(xiàn)了明顯的氧化損傷。在氧化損傷肝細胞培養(yǎng)基中加入ω-3魚油脂肪乳的觀察組，與未加ω-3魚油脂肪乳的模型組相比，細胞存活率顯著增高，細胞內(nèi)脂滴減少，細胞內(nèi)ROS及MDA水平降低，細胞培養(yǎng)上清液ALT、AST下降，細胞內(nèi)SOD升高。表明ω-3魚油脂肪乳能降低氧化損傷肝細胞內(nèi)ROS，調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)代謝，增加細胞SOD的合成，對肝細胞氧化損傷起到修復(fù)作用。其原因是ω-3魚油脂肪乳的有效成分是ω-3多不飽和脂肪酸和DHA。ω-3多不飽和脂肪酸可調(diào)節(jié)脂類介質(zhì)合成和細胞因子釋放，從而發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。DHA具有很強的清除·OH和O2·的能力，可提高還原型輔酶的活力，抑制磷酸酶的活性，降低細胞內(nèi)ROS，促進細胞增殖[9]。

PPAR是可被過氧化物酶體增殖物激活的轉(zhuǎn)錄因子，包括PPARα、PPARβ 及PPARγ 3種亞型。PPARα主要表達在肝細胞，具有調(diào)節(jié)脂肪代謝、炎性反應(yīng)、免疫功能及細胞分化等作用[10]。肝臟內(nèi)PPARα表達下降可引起細胞能量代謝紊亂、微血管周圍炎癥、脂肪沉積，引起脂蛋白合成代謝障礙，脂肪酸在肝臟氧化減少，肝臟脂質(zhì)沉積[11]。李金蓮等[12]的研究表明PPARα在H2O2對肝細胞氧化損傷起保護作用。L-FABP是脂肪酸結(jié)合蛋白家族重要成員，在肝臟、小腸、腎等組織中均有表達。L-FABP具有調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、膽固醇、膽汁酸等轉(zhuǎn)運的功能[13]。L-FABP直接調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸代謝，間接調(diào)節(jié)脂肪酸在肝細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運與吸收，維持肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[11]。L-FABP 作為內(nèi)源性抗氧化劑在肝細胞氧化損傷中發(fā)揮了重要作用。L-FABP 對多不飽和脂肪酸和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物有很高的親和力和結(jié)合能力，L-FABP通過結(jié)合多不飽和脂肪酸來調(diào)節(jié)脂肪酸在細胞內(nèi)氧化途徑的利用度，從而控制ROS 的釋放量[14]。PPARα可直接與L-FABP發(fā)生核信號傳導(dǎo)構(gòu)成L-FABP / PPARα信號通路，形成了正反饋調(diào)節(jié)[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組細胞PPARα mRNA及L-FABP蛋白相對表達量低于對照組,說明氧化損傷會導(dǎo)致肝細胞內(nèi)的PPARα mRNA及L-FABP蛋白表達降低。觀察組細胞PPARα mRNA及L-FABP蛋白相對表達量高于模型組，說明ω-3魚油脂肪乳能夠上調(diào)肝細胞內(nèi)PPARα mRNA及L-FABP蛋白的表達水平，通過正反饋調(diào)節(jié)L-FABP / PPARα信號通路改善肝細胞氧化損傷程度。

綜上所述，ω-3魚油脂肪乳可修復(fù)人肝細胞系HL7702細胞氧化損傷，機制可能與其上調(diào)L-FABP / PPARα信號通路的表達，維持肝細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。

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Repair function of ω-3 fish oil fat emulsion on oxidative damage in liver cells and its mechanism

LIZhiqiang,YANGDagang,WANGHuiqun

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the repair function of ω-3 fish oil fat emulsion on oxidative damage in liver cells and to explore its mechanism. Methods Human hepatic cell line HL7702 was cultured in vitro. HL7702 cells were divided into the control group, model group and observation group, and each group was divided into 9 holes. The control group was cultured with conventional culture medium, in the model and the observation groups, we added 500 μmol/L hydrogen peroxide (H2O2) to the culture medium, after 1 hour, the observation group was added with 0.5% ω-3 fish oil fat emulsion, and then we set a blank control group which was only added with the culture medium without cells. After 4 h of culture, the cells in each group were collected. We observed the intracellular lipid droplets by oil red O staining and calculated the cell survival rate by CCK-8, measured reactive oxygen species (ROS) in the cells of each group by DCFH-DA fluorescence probe, detected the alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in the supernatant of each group by colorimetric assay, the triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) by COD-PAP single reagent colorimetric method, malondialdehyde (MDA) by thiobarbituric acid and superoxide dismutase (SOD) by xanthine oxidase, the relative expression of peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPAR-α) mRNA by real-time fluorescence quantitative PCR, and the relative expression of liver fatty acid-binding protein (L-FABP) protein by Western blotting. Results Under microscope, the intracellular lipid droplets were orange. The HL7702 liver cells in the control group arrayed closely, and only a few orange red lipid droplets appeared. In the model group, a large number of orange red lipid droplets were observed and accompanied by lipid droplets. In the observation group, the liver cells showed more orange lipid droplets, but they were significantly decreased as compared with those of the model group. The cell survival rates of the control group, the model group and the observation group were 100%, 67.25%±4.68%, and 71.72%±2.47%. The survival rate of the observation group was higher than that of the model group (P<0.05), but was lower than that of the control group (P<0.05). Compared with the control group, the intracellular ROS of the model group was increased (P<0.05), the ALT and AST in cell culture supernatants were increased (allP<0.05), and the intracellular TG, TC, MDA were increased (allP<0.05), the SOD was decreased (P<0.05), the PPARα mRNA was decreased (P<0.05) and the relative expression of L-FABP protein was decreased (P<0.05). Compared with the model group, the intracellular ROS of the observation group was decreased (P<0.05), the ALT and AST in cell culture supernatants were decreased (allP<0.05), the intracellular TG, TC, MDA were decreased (allP<0.05), the SOD was increased (P<0.05), the PPARα mRNA was increased (P<0.05) and the relative expression of L-FABP protein was increased (P<0.05). Conclusions ω-3 fish oil fat emulsion can repair oxidative damage in human hepatic cell line HL7702, and its mechanism may be related to the up-regulation of the expression of L-FABP/ PPARα signaling pathway and the maintenance of lipid homeostasis in liver cells.

ω-3 fish oil fat emulsion; hepatic cells; oxidative damage; cell survival; peroxisome proliferator-activated receptor-α; liver fatty acid-binding protein

貴州省國際科技合作計劃項目(20137023)。

李智強( 1984- ) ，男，碩士研究生，主要研究方向為肝臟疾病。E-mail: 969951219@qq.com

簡介：楊大剛( 1971- ) ，男，碩士，副教授，主要研究方向為肝膽胰疾病。E-mail: ydg435888@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.007

R575

A

1002-266X(2016)47-0025-04

2016-08-15)