谷氨酰胺對斷奶應(yīng)激仔豬大腸黏膜抗氧化性能和增殖細(xì)胞核抗原表達的影響

陳 靜,王 麗

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

?

谷氨酰胺對斷奶應(yīng)激仔豬大腸黏膜抗氧化性能和增殖細(xì)胞核抗原表達的影響

陳 靜,王 麗

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

將40頭(28±1)日齡的長白×約克夏斷奶仔豬隨機分為2組，每組設(shè)5個重復(fù)，分別飼喂基礎(chǔ)日糧(對照組)、基礎(chǔ)日糧+1.2%谷氨酰胺(谷氨酰胺組)，研究日糧中添加谷氨酰胺對斷奶仔豬大腸黏膜抗氧化性能和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達的影響。試驗第7天，取仔豬大腸組織，測定其抗氧化指標(biāo)和PCNA的表達情況。結(jié)果表明，谷氨酰胺組大腸黏膜的CAT活性、GSH和NO含量分別比對照組顯著提高162.7%、8.3%和47.8%；日糧中添加谷氨酰胺降低了大腸黏膜MDA含量，但與對照組差異未達到顯著水平；谷氨酰胺組大腸中PCNA蛋白陽性面積比顯著高于對照組61.2%。可見，斷奶仔豬日糧中添加1.2%谷氨酰胺能提高大腸黏膜的抗氧化性能，并對大腸黏膜細(xì)胞的增殖有一定促進作用。

谷氨酰胺； 抗氧化性能； PCNA； 大腸； 斷奶仔豬

谷氨酰胺是機體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸，是嘌呤和嘧啶核苷酸以及氨基糖合成的前體物，具有許多重要的生理功能。在腸道中，谷氨酰胺可維持腸黏膜細(xì)胞的代謝，促進黏膜細(xì)胞分裂增殖，加快上皮增生與修復(fù)，保護黏膜屏障，提高腸黏膜的抗氧化性能，抑制其通透性[1]。目前，谷氨酰胺對腸道的研究主要集中在小腸，對于豬的主要發(fā)酵器官——大腸的研究較少。大腸對動物消化功能有非常重要的作用。大腸微生物能發(fā)酵分解小腸中未消化的日糧纖維，產(chǎn)生豐富的揮發(fā)性脂肪酸等物質(zhì)，為動物提供能量[2]。對斷奶仔豬而言，由于發(fā)育的不完善和飼糧的改變，大腸上皮黏膜細(xì)胞易受到氧自由基的攻擊，影響大腸發(fā)酵功能的同時也影響仔豬的消化效率[3]。前期研究表明，日糧中添加1.2%谷氨酰胺可以顯著提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能，緩解斷奶應(yīng)激[4]。為了進一步探索谷氨酰胺對大腸功能的影響，本研究以斷奶仔豬為試驗對象，研究谷氨酰胺對大腸黏膜的抗氧化性能和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達的影響，以闡明谷氨酰胺對大腸功能的調(diào)節(jié)作用，也為揭示谷氨酰胺的營養(yǎng)調(diào)控機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與試驗日糧

選用40頭(28±1)日齡平均體質(zhì)量為(6.8±0.3)kg的長白×大約克夏二元雜交斷奶仔豬作為供試動物。仔豬基礎(chǔ)日糧配方和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方和營養(yǎng)水平

注：每千克日糧含有：維生素A 15 000 IU、維生素B13.0 mg、維生素B29.0 mg、維生素B66.0 mg、維生素B120.03 mg、維生素D33 300 IU、維生素E 60 IU、維生素K36.0 mg、煙酸 60.0 mg、泛酸 18.0 mg、葉酸 1.5 mg、生物素 0.46 mg、氯化膽堿 750 mg、銅12 mg、鐵80 mg、鋅75 mg、碘0.35 mg、錳10 mg、硒0.30 mg。粗蛋白、鈣和磷為實測值，其他均為計算值。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

本試驗采用單因素完全隨機設(shè)計。將40頭二元雜交仔豬隨機分為2組，即對照組和谷氨酰胺組，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，谷氨酰胺組在基礎(chǔ)日糧中添加1.2%的谷氨酰胺。每個處理5個重復(fù)。日糧為粉料，仔豬自由采食，乳頭飲水器自由飲水。試驗豬舍防疫按照常規(guī)程序進行。

1.3 樣本制備

試驗第7天，每個處理重復(fù)隨機選取并屠宰1頭仔豬，將盲腸組織(中段)取出，一部分組織進行黏膜抗氧化性能測定，另一部分組織進行石蠟切片后，采用S-P免疫組織化學(xué)染色方法對大腸黏膜細(xì)胞PCNA表達情況進行檢測。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 大腸黏膜抗氧化性能 將大腸組織(盲腸中段)黏膜與生理鹽水制成10%勻漿，測定大腸黏膜過氧化氫酶(CAT)的活性，谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量。試驗方法按南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒說明書進行。

1.4.2 PCNA表達

1.4.2.1 PCNA的免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片脫臘。3%H2O2去離子水和蒸餾水混合，室溫孵育5～10 min。蒸餾水沖洗，PBS浸泡數(shù)分鐘。用正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育15 min，傾去。谷氨酰胺組分別滴加適當(dāng)比例的PCNA一抗(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次。在37 ℃下用生物素化二抗(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)工作液孵育15 min。PBS沖洗3次后，在37 ℃下用辣根酶標(biāo)記鏈卵白素工作液孵育15 min。PBS沖洗。在室溫下，用DAB顯色液顯色5 min，蒸餾水洗滌3次。 蘇木精輕度復(fù)染10 min。水洗返蘭30 min。脫水、透明，最后封片。

1.4.2.2 PCNA表達 用捷達圖像分析系統(tǒng)對組織切片進行分析，每片組織切片隨機觀察5個視野。測定每個視野內(nèi)免疫組化陽性細(xì)胞(即細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞)的面積占所觀察視野面積的百分比。本試驗采用的免疫組化染色試劑盒為北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.5 統(tǒng)計分析

本試驗統(tǒng)計分析均采用SPSS 17.0軟件中的獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異顯著，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酰胺對斷奶仔豬大腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可知，仔豬日糧中添加谷氨酰胺對大腸黏膜的CAT活性、GSH和NO含量影響顯著。與對照組相比，谷氨酰胺組大腸黏膜中的CAT活性、GSH和NO含量分別顯著提高162.7%、8.3%和47.8%，說明谷氨酰胺提高了腸道黏膜的抗氧化性能。在MDA含量方面，日糧中添加谷氨酰胺可降低MDA含量，較對照組降低13.9%，但2個處理間差異未達到顯著水平。

表2 谷氨酰胺對斷奶仔豬大腸抗氧化指標(biāo)的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 谷氨酰胺對斷奶仔豬大腸黏膜PCNA表達的影響

本試驗中，谷氨酰胺對仔豬大腸黏膜PCNA蛋白陽性面積比的影響達到了顯著水平。谷氨酰胺組仔豬大腸的PCNA蛋白陽性面積比顯著高于對照組61.2%(P<0.05)。本試驗免疫組化染色結(jié)果顯示(圖1)，腸黏膜增殖細(xì)胞主要位于黏膜中下部。

A.對照組(40×); B.谷氨酰胺組(40×)

3 結(jié)論與討論

3.1 谷氨酰胺對斷奶仔豬大腸的抗氧化性能的影響

無論是腸組織形態(tài)的變化，還是黏膜細(xì)胞的凋亡與增殖，都與腸黏膜抗氧化性能有關(guān)。仔豬斷奶后，由于生理和飼料改變使機體產(chǎn)生氧自由基,氧自由基能攻擊腸道細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過氧化物[5]，同時導(dǎo)致NO含量增加，NO合成酶的mRNA表達量也下降，降低了NO對腸黏膜的保護作用，加重了腸黏膜的損傷[6]。這種損傷不僅降低胃腸細(xì)胞的吸收能力，更嚴(yán)重的是黏膜通透性加大，造成腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素移位[7]。還原型GSH是體內(nèi)保護組織細(xì)胞免受自由基損傷、維護組織正常結(jié)構(gòu)與功能的一種重要的抗氧化劑。GSH含量是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[8]。CAT具有防止細(xì)胞氧中毒的作用[9]。

本試驗結(jié)果表明，外源補充谷氨酰胺提高了斷奶應(yīng)激仔豬大腸的GSH含量，這是因為谷氨酰胺是合成還原型GSH的重要前體物質(zhì)。谷氨酰胺在小腸中被利用后經(jīng)脫氨反應(yīng)產(chǎn)生谷氨酸而合成GSH[10]。席鵬彬等[11]認(rèn)為，外源谷氨酰胺能夠補充消失的母源乳汁中的谷氨酰胺，維持和增加腸黏膜細(xì)胞內(nèi)GSH的合成與儲備，提高腸黏膜細(xì)胞的抗氧化損傷能力，同時增加了CAT活性，降低細(xì)胞毒性，減少了MDA的生成。此外，谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的精氨酸也是合成NO的前體，因此，谷氨酰胺的添加降低了自由基的損害，提高了腸道的屏障功能，保持了大腸黏膜的完整性。本試驗結(jié)果與王現(xiàn)盟[12]的研究結(jié)果相近。

3.2 谷氨酰胺對斷奶仔豬大腸黏膜PCNA表達的影響

PCNA又稱周期蛋白，是一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的核內(nèi)蛋白質(zhì)[13]，是細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個重要評價指標(biāo)[14]。正常生理情況下，豬腸道表面大量黏膜細(xì)胞處于快速增殖的狀態(tài)，細(xì)胞的更新需要的能量主要由血流供應(yīng)和腸腔內(nèi)的食物來供應(yīng)。而斷奶應(yīng)激下，由于神經(jīng)內(nèi)分泌因素和細(xì)胞因子的作用，仔豬會出現(xiàn)食欲抑制，導(dǎo)致腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)減少，同時應(yīng)激造成黏膜血管收縮、血流量減少，PCNA合成減少，從而限制了黏膜增生的速度，黏膜出現(xiàn)萎縮，導(dǎo)致腸屏障功能受損。

谷氨酰胺不僅是抗氧化物質(zhì)合成的底物，還是合成營養(yǎng)成分的原料與底物。谷氨酰胺被認(rèn)為是黏膜細(xì)胞首選的呼吸底物，其氨基氮也被用來合成嘧啶、嘌呤、α-氨基和碳鏈，以及促進細(xì)胞增殖的氨基酸，如鳥氨酸、精氨酸等[15]。本試驗結(jié)果表明，仔豬日糧中添加谷氨酰胺，提高了大腸黏膜PCNA的陽性表達面積比，說明谷氨酰胺促進了腸黏膜細(xì)胞的增殖。張軍民[16]研究表明，斷奶仔豬日糧中加入谷氨酰胺使腸黏膜質(zhì)量和黏膜DNA含量顯著增加，這可能與PCNA增加有關(guān)。Milan等[17]也證實，谷氨酰胺二肽能顯著提高腸道的增殖率，提高腸道固有層PCNA細(xì)胞陽性表達面積比。PCNA主要在大腸黏膜中下部表達，這種表達特點體現(xiàn)了胃腸黏膜上皮自基底向表層逐漸成熟、衰老、死亡的生長規(guī)律。

本試驗結(jié)果表明，斷奶仔豬日糧中添加1.2% 的谷氨酰胺能顯著提高大腸黏膜的抗氧化性能和增殖細(xì)胞核抗原的表達。

[1] 楊家軍,張敏紅,馮京海.早期斷奶對仔豬腸上皮細(xì)胞氧化與損傷的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,40(1):77-82．

[2] 鐘永興,梁展雯,胡光源,等.豬大腸消化生理的研究進展[J].中國畜牧雜志,2009,45(13):63-66.

[3] 劉巧婷,何若鋼,劉謹(jǐn),等.谷氨酰胺對保育豬生長性能、免疫器官及其小腸形態(tài)學(xué)發(fā)育程度影響的研究[J].飼料工業(yè),2014(15):35-40.

[4] 陳靜,劉顯軍,邊連全,等.谷氨酰胺對早期段仔豬生長性能和免疫性能的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,15(4):58-62.

[5] 張海平,程小愛.水澇脅迫下歐李丙二醛和氧自由基的變化[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,21(12):15-20.

[6] Janero D R.Nitric oxide(NO)related pharmaceuticals:Contemporary approaches to therapeutical NO modulation [J].Free Radical Bio Med,2002,28(10):1495-1506.

[7] 張秀英.斷奶應(yīng)激對仔豬血清抗氧化功能指標(biāo)的影響[J].畜禽業(yè),2010(11):42-43.

[8] 趙駿,楊超,王傳鵬,等.芹菜素對雄性小鼠肝臟組織總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽值、丙二醛含量影響研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013(18): 7-9.

[9] 楊家軍.早期斷奶仔豬腸上皮細(xì)胞氧化與損傷及二氫楊梅素對其調(diào)控作用[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2012:60-62.

[10] 連慧香,程豐,朱鳳霞,等.飼喂鮮胡蘿卜對豫南黑豬產(chǎn)后母豬健康狀況及血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,44(7):128-131.

[11] 席鵬彬,林映才,蔣宗勇,等.谷氨酰胺二肽對斷奶仔豬生長、免疫、抗氧化力和小腸粘膜形態(tài)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2007,19(2):135-141.

[12] 王現(xiàn)盟.谷氨酰胺對斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)和細(xì)胞能量合成的影響[D].杭州:浙江大學(xué),2010:43-44.

[13] Noha G B,Ezzat A E E.Immunoelectron microscope localization of androgen receptors and proliferating cell nuclear antigen in the epithelial cells of albino rat ventral prostate[J].Journal of Microscopy and Ultrastructure,2015,3(2):75-81.

[14] 章平,張自富.FSH激活的ERKl/2信號通路在GC細(xì)胞增殖分化過程中的作用[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(8):120-125.

[15] Kan C C,Chung T Y,Hsieh M H.Gene expression profiling of rice seedlings in response to glutamine treatment[J].Genomics Data,2015,6:123-124.

[16] 張軍民.谷氨酰胺對早期斷奶仔豬腸道的保護作用及其機理研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,2000:71-77.

Effects of Dietary Glutamine on Antioxidant Traits and Expression of PCNA of Large Intestine of Weaned Piglets

CHEN Jing,WANG Li

(College of Animal Science & Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

In order to determine the effect of glutamine on antioxidation and cell proliferation of large intestine of weaned piglets,a total of 40 crossbred (Landrace×Yorkshire) pigs were divided into two treatments based on weight and gender.The control group were fed with basal diet,glutamine group were fed with diet added 1.2% glutamine.On the seventh day after weaned,antioxidant traits and masculin area rate of PCNA of large intestine mucosal were measured.The results showed that glutamine supplementation significantly increased GSH,CAT and NO concentrations by 8.3%,162.7% and 47.8%,respectively,compared with the control diet.There was no differences in MDA concentration of large intestine mucosal between two treatments.Pigs fed with diet supplemented with glutamine had 61.2% greater PCNA masculin area rate in large intestine compared that fed with control diet.The test results showed the addition of 1.2% glutamine could significantly increase antioxidation and cell proliferation of large intestine in piglets.

glutamine; antioxidation; PCNA; large intestine; weaned piglets

2016-05-10

遼寧省自然科學(xué)基金項目(2014027014)；遼寧省教育廳項目(L2013259)

陳 靜 (1975-)，女，遼寧北票人，講師，博士，主要從事動物營養(yǎng)與免疫調(diào)控研究。E-mail:chenjinglxj@163.com

S816.7

A

1004-3268(2016)11-0122-04