1株耐高溫產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的篩選鑒定及其液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

敖 靜，桓明輝，李 楊，劉曉輝，高曉梅，徐 沖

(遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧 朝陽(yáng) 122000)

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1株耐高溫產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的篩選鑒定及其液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

敖 靜，桓明輝，李 楊，劉曉輝，高曉梅，徐 沖

(遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧 朝陽(yáng) 122000)

為高效發(fā)酵雞糞，在雞糞發(fā)酵高溫時(shí)期(≥50 ℃)篩選到11株菌株，確定其中1株高溫細(xì)菌GX7具有較高的蛋白酶活力。經(jīng)16S rDNA測(cè)序并進(jìn)行同源性比較可知，GX7與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的16S rDNA 序列相似性達(dá)到100%；通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)合生理生化試驗(yàn)，鑒定GX7為枯草芽孢桿菌。通過(guò)繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、測(cè)定細(xì)菌蛋白酶活力可知，細(xì)菌GX7的蛋白酶活力與菌數(shù)呈強(qiáng)正相關(guān)。從發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及菌株的培養(yǎng)條件等方面優(yōu)化枯草芽孢桿菌GX7產(chǎn)蛋白酶的條件，結(jié)果顯示，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：酵母浸膏1.5%、玉米粉1.5%、MgSO40.5%；最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH值8.1、培養(yǎng)溫度37 ℃、接菌量2%、裝液量50 mL(250 mL)、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。在此條件下，活菌數(shù)提高1個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到2.56×109cfu/mL，蛋白酶活力提高約3倍，為26 U/mL。

耐高溫; 蛋白酶; 細(xì)菌; 鑒定; 發(fā)酵條件優(yōu)化

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，畜禽糞便的產(chǎn)量也急劇增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)畜禽糞便的年總量高達(dá)20億t，是工業(yè)廢棄物的3.2倍[1]。利用微生物菌劑進(jìn)行堆肥發(fā)酵是將畜禽糞便無(wú)害化處理的最有效手段之一。堆肥發(fā)酵是微生物通過(guò)代謝繁殖將有機(jī)質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)態(tài)養(yǎng)分的過(guò)程，通過(guò)添加外源微生物能大幅度提高堆肥腐熟的速度和效果[2]。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者在利用微生物發(fā)酵堆肥方面進(jìn)行了大量研究，其中，石春芝等[3]用雞糞、豬糞和稻殼混合堆肥，通過(guò)添加0.5%的快速發(fā)酵菌劑，顯著縮短了發(fā)酵時(shí)間，堆制14～21 d即達(dá)到有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)；高華等[4]利用自行分離篩選的菌株復(fù)合作為除臭菌劑，對(duì)雞糞進(jìn)行對(duì)比發(fā)酵，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0～10 d時(shí)，氨氣釋放量減少了21%，同時(shí)硫化氫的產(chǎn)生也有所減少，通過(guò)添加除臭菌劑提早20 d消除了臭味，除臭效果明顯；席北斗等[5]發(fā)現(xiàn)，添加高效復(fù)合微生物菌劑的成品肥料含有大量有益菌群，是一種良好的生物活性肥料。生物有機(jī)肥中含有許多功能菌，如產(chǎn)纖維素酶菌株、產(chǎn)淀粉酶菌株等，分離篩選具有特定功效的功能菌并將其用于發(fā)酵堆肥具有重要意義。目前，關(guān)于從發(fā)酵雞糞中篩選具有較高蛋白酶活力菌株的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，為此，本研究在雞糞發(fā)酵高溫時(shí)期篩選產(chǎn)蛋白酶菌株，并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為雞糞發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 雞糞 由遼寧省微生物科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室采集保存。

1.1.2 培養(yǎng)基配置 NA培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，pH值7.0～7.2，121 ℃高溫滅菌30 min。

酪蛋白培養(yǎng)基：干酪素1%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、瓊脂1.5%～2%、酵母浸膏0.1%，pH值7.0～7.5，121 ℃高溫蒸汽滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵液培養(yǎng)基：蔗糖1%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，pH值7.0～7.2，121 ℃高溫滅菌30 min[6]。

液體搖瓶培養(yǎng)條件：pH值7.0、37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、裝液量50 mL(250 mL)、接菌量2%[7]。

1.1.3 儀器 主要有可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，T6新悅)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX-75KB)、恒溫?fù)u床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，SPF-2008)。

1.2 菌種初篩

取樣方法：雞糞自然堆肥發(fā)酵，高溫階段(≥50 ℃)從糞堆的不同深度部位取樣3份，將3份樣品充分混合后，稱取1.0 g置于99 mL無(wú)菌水中，振蕩約30 min。梯度稀釋至10-5倍，分別利用劃線法于NA培養(yǎng)基上(50±2)℃倒置培養(yǎng)24 h[8]。從中挑選形態(tài)不同的單菌落，利用平板劃線法將其純化。

1.3 蛋白酶活力測(cè)定

定性分析：將分離出的所有菌株點(diǎn)接在酪蛋白培養(yǎng)基平板上，于(50±2)℃培養(yǎng)，每4 h觀察1次，至48 h結(jié)束。挑選透明圈明顯的菌株，測(cè)量其菌落直徑與透明圈直徑[9]。

定量分析：采用福林酚法[10]測(cè)定蛋白酶活力。

1.4 鑒定方法

1.4.1 生理生化鑒定 將菌株按劃線法接到NA培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌落形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)[11-12]，并對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.4.2 16S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rDNA測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司完成。將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，利用Mega軟件進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌數(shù)及產(chǎn)酶活力影響的測(cè)定

取14個(gè)裝有50 mL NA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、28、32 h。吸取1 mL菌種(37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h)分別加入14個(gè)三角瓶中，液體搖瓶培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并按標(biāo)注的培養(yǎng)時(shí)間取相應(yīng)的三角瓶，立即放入冰箱中冷藏，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行處理[13]。以未接菌的NA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)OD600值，并計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)蛋白酶活力。

1.6 液體培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)

采用液體搖瓶培養(yǎng)條件培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間12 h，用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.6.1 碳源 分別用1%的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米粉替代基礎(chǔ)發(fā)酵液培養(yǎng)基中1%的蔗糖。

1.6.2 氮源 分別用1%的硝酸鈉、氯化銨、酵母浸膏、黃豆餅粉替代基礎(chǔ)發(fā)酵液培養(yǎng)基中1%的蛋白胨。

1.6.3 無(wú)機(jī)鹽 分別用0.5%的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、K2HPO4+KH2PO4(1∶1)替代基礎(chǔ)發(fā)酵液培養(yǎng)基中0.5%的NaCl[14]。

1.6.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)篩選出的最優(yōu)碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽3個(gè)重要因素，選用三因素三水平L9(33)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行[15]，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 GX7液體培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) %

1.7 液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以優(yōu)化后的最優(yōu)培養(yǎng)液配方培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間12 h，用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.7.1 初始pH值 將初始pH值用20% NaOH和0.5 mol/L HCl分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0(未調(diào)前培養(yǎng)基pH值為4.6)。接種量為1 mL，裝液量為50 mL(250 mL)，于恒溫?fù)u床中37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。選出菌數(shù)較高pH值為6.0～8.0，在此范圍內(nèi)將pH值調(diào)至6.6、6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、8.4，研究細(xì)化pH值對(duì)菌數(shù)的影響。

1.7.2 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為25、30、35、40、45、50、55 ℃，其他培養(yǎng)條件同上。

1.7.3 接種量 將接種量分別設(shè)為1%、2%、3%、4%、5%，其他培養(yǎng)條件同上。

1.7.4 裝液量 250 mL三角瓶中裝液量分別設(shè)為10、25、50、75、100 mL，其他培養(yǎng)條件同上。

1.7.5 搖床轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)速分別設(shè)為60、100、140、180、220 r/min，其他培養(yǎng)條件同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)用菌株的初步篩選及產(chǎn)酶活力大小定性比較

試驗(yàn)共分離純化出11株菌株，分別編號(hào)GX1—GX11(表2)。

D/d值較高說(shuō)明菌株分解酪蛋白能力較強(qiáng)。由表2可以看出，細(xì)菌GX7 D/d為3.00，分解酪蛋白能力比其他菌株強(qiáng)。

表2 菌株GX1—GX11分解酪蛋白能力測(cè)定結(jié)果

2.2 試驗(yàn)用菌株蛋白酶活力大小定量比較

根據(jù)圖1或用回歸方程計(jì)算得出，當(dāng)吸光度為1時(shí)，酪氨酸的量為97.9 μg，即吸光常數(shù)K值為97.9。從圖2可以看出，高溫細(xì)菌中GX7的蛋白酶活力最高，約為9 U/mL，而其他菌株的蛋白酶活均在4 U/mL以下。

圖1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 細(xì)菌蛋白酶活力比較

2.3 細(xì)菌GX7形態(tài)學(xué)特征比較及生理生化試驗(yàn)

細(xì)菌GX7形態(tài)學(xué)特征為菌落小、白色、形狀不規(guī)則、表面起褶皺、邊緣鋸齒狀、不產(chǎn)色素；有芽孢、橢圓形、中生；桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定細(xì)菌GX7為芽孢桿菌屬。

從表3可以看出，細(xì)菌GX7生化試驗(yàn)結(jié)果為：葡萄糖產(chǎn)氣、不產(chǎn)酸，麥芽糖、硝酸鹽還原、明膠液化、VP等試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，乳糖、西蒙氏檸檬酸鹽、吲哚等試驗(yàn)結(jié)果陰性，符合芽孢桿菌屬的生化特征。

表3 細(xì)菌GX7的生化特征

注：+表示陽(yáng)性，-表示陰性。

2.4 細(xì)菌GX7的16S rDNA 序列比對(duì)

使用BLAST將GX7的16S rDNA序列提交到 NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，GX7與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的16S rDNA 序列相似性達(dá)到100%，可以初步確認(rèn)細(xì)菌GX7為枯草芽孢桿菌。

從GenBank中選擇8個(gè)菌株與GX7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)進(jìn)化育樹(shù)。如圖3所示，菌株GX7與Bacillussubtilisstrain TAT1-8親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步證明GX7為枯草芽孢桿菌。

圖3 細(xì)菌GX7的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.5 細(xì)菌GX7的生長(zhǎng)曲線及酶活力變化曲線

生長(zhǎng)曲線是反映菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的曲線，分為4個(gè)階段：遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，通過(guò)生長(zhǎng)曲線可以判斷菌株的最佳培養(yǎng)時(shí)間。從圖4可以看出，細(xì)菌GX7培養(yǎng)12 h內(nèi)菌數(shù)逐漸升高，蛋白酶活力也隨之增高；超過(guò)12 h后，菌數(shù)開(kāi)始降低，酶活力也隨之降低；培養(yǎng)至12 h時(shí)，OD600值最高，即菌數(shù)最多，所以最佳培養(yǎng)時(shí)間為12 h。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GX7的菌數(shù)及產(chǎn)酶活力的影響

從圖5可以看出，酶活力與菌數(shù)關(guān)系密切。GX7的蛋白酶活力與菌數(shù)的相關(guān)系數(shù)r=0.984，表明細(xì)菌GX7的蛋白酶活力與菌數(shù)呈強(qiáng)正相關(guān)(r>0，為正相關(guān)，且r>0.8，為強(qiáng)正相關(guān))。因此，培養(yǎng)基優(yōu)化可將菌數(shù)高低作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 GX7蛋白酶活力與菌數(shù)的相關(guān)性

2.6 細(xì)菌GX7液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.6.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1.1 碳源對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖6可以看出，玉米粉和可溶性淀粉為碳源時(shí)，GX7的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于葡萄糖、乳糖和蔗糖；利用玉米粉和可溶性淀粉作為碳源發(fā)酵后，GX7活菌數(shù)超過(guò)2.87×108cfu/mL。而利用其他3種碳源時(shí)，其活菌數(shù)在0.85×108cfu/mL以下，說(shuō)明GX7利用淀粉的能力優(yōu)于單糖和二糖，利用玉米粉的能力優(yōu)于可溶性淀粉?？梢?jiàn)，GX7生長(zhǎng)的最佳碳源是玉米粉，其次是可溶性淀粉。

圖6 不同碳源對(duì)活菌數(shù)的影響

2.6.1.2 氮源對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖7可以看出，酵母浸膏、黃豆餅粉和蛋白胨為氮源時(shí)，GX7的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于硝酸鈉和氯化銨，其活菌數(shù)可達(dá)到6.22×108cfu/mL以上， 說(shuō)明GX7利用有機(jī)氮源的能力優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源。利用有機(jī)氮源的能力依次為酵母浸膏>黃豆餅粉>蛋白胨，這與酵母浸膏中富含氨基酸、維生素及未知生長(zhǎng)因子有關(guān)[16]?？梢?jiàn)，GX7生長(zhǎng)的最佳氮源是酵母浸膏。

圖7 不同氮源對(duì)活菌數(shù)的影響

2.6.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖8可以看出，Zn2+和Fe2+對(duì)GX7的生長(zhǎng)略有抑制作用，菌數(shù)均低于NaCl； MgSO4對(duì)GX7的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，其活菌數(shù)可達(dá)到4.26×109cfu/mL；K2HPO4與KH2PO4(1∶1)混合時(shí)，GX7的活菌數(shù)達(dá)到1.58×109cfu/mL，說(shuō)明K+對(duì)GX7的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，也可能是由于K2HPO4和KH2PO4形成了緩沖溶液，對(duì)溶液的pH值產(chǎn)生了一定的緩沖作用，導(dǎo)致菌數(shù)增多?？梢?jiàn)，GX7生長(zhǎng)的最佳無(wú)機(jī)鹽為MgSO4。

圖8 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌數(shù)的影響

2.6.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 確定最佳碳源是玉米粉，最佳氮源是酵母浸膏，最佳無(wú)機(jī)鹽是MgSO4，選用三因素三水平L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 GX7液體培養(yǎng)基優(yōu)化的L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)正交試驗(yàn)可知，RB>RA>RC，3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)锽>A>C，利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS計(jì)算得FA=3.330，F(xiàn)B=4.657，F(xiàn)C=0.214，即酵母浸膏(B)在這3個(gè)因素中影響最大，玉米粉(A)次之， MgSO4(C)最小。由表5可以得出，最優(yōu)配方為A3B3C2，即酵母浸膏1.5%、玉米粉1.5%、MgSO40.5%。

2.7 細(xì)菌GX7液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.7.1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖9可以看出，隨著pH值的升高，細(xì)菌GX7活菌數(shù)隨之增加，當(dāng)pH值為8.1時(shí)，活菌數(shù)最高；當(dāng)pH值大于8.1時(shí)，細(xì)菌GX7活菌數(shù)有所下降。因此，確定GX7 的最適pH值為8.1。

圖9 不同初始pH值對(duì)活菌數(shù)的影響

2.7.2 培養(yǎng)溫度對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖10可以看出，25～35 ℃，細(xì)菌GX7的活菌數(shù)隨溫度升高而增加；當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，細(xì)菌GX7的活菌數(shù)隨溫度升高而減少，但由于GX7在高溫條件下篩選出，所以，溫度升高到55 ℃時(shí)，仍有活菌?？梢?jiàn)，細(xì)菌GX7的最適生長(zhǎng)溫度是35～40 ℃，根據(jù)試驗(yàn)具體情況，選用細(xì)菌常用培養(yǎng)溫度37 ℃。

圖10 不同培養(yǎng)溫度對(duì)活菌數(shù)的影響

2.7.3 接菌量對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖11可以看出，接菌量小于3%時(shí)，細(xì)菌GX7的活菌數(shù)隨接菌量的增加略有增加；當(dāng)接菌量大于3%時(shí)，活菌數(shù)有所下降，說(shuō)明接種量過(guò)大或者過(guò)小都會(huì)影響到活菌數(shù)，過(guò)小會(huì)造成細(xì)菌長(zhǎng)勢(shì)較慢，過(guò)大又會(huì)引起溶氧或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足而導(dǎo)致菌數(shù)減少。因此，最佳接菌量為2%～3%。接菌量為2%和3%時(shí)，菌數(shù)相差較小，因此，確定GX7液體培養(yǎng)最佳接菌量為2%。

圖11 不同接菌量對(duì)活菌數(shù)的影響

2.7.4 裝液量對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖12可以看出，250 mL三角瓶中裝液量小于50 mL時(shí)，菌數(shù)隨裝液量的增加而增加；而裝液量超過(guò)50 mL以后，菌數(shù)開(kāi)始減少。由此可知，裝液量的多少對(duì)菌株的生長(zhǎng)有一定影響，裝液量過(guò)少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，不利于菌株生長(zhǎng)；裝液量過(guò)大則通氧量減少，導(dǎo)致菌數(shù)下降[17]。因此，細(xì)菌GX7的液體培養(yǎng)最佳裝液量為50 mL(250 mL)。

圖12 不同裝液量對(duì)活菌數(shù)的影響

2.7.5 轉(zhuǎn)速對(duì)活菌數(shù)的影響 從圖13可以看出，振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速小于140 r/min時(shí)， 菌數(shù)隨轉(zhuǎn)速的加快而增加；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于140 r/min時(shí)，菌數(shù)基本保持不變。由此可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)小時(shí)，培養(yǎng)基通氧量不足，不利于菌株生長(zhǎng)；當(dāng)通氧量達(dá)到菌株生長(zhǎng)所需的極限時(shí)，轉(zhuǎn)速雖然增加，但菌數(shù)基本保持不變。因此，確定GX7液體培養(yǎng)最佳搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min。

圖13 不同轉(zhuǎn)速對(duì)活菌數(shù)的影響

配方優(yōu)化前，GX7的菌數(shù)為0.85×108cfu/mL；蛋白酶活力為9 U/mL。通過(guò)以上試驗(yàn)，在最佳培養(yǎng)條件下，GX7的菌數(shù)提高至2.56×109cfu/mL；蛋白酶活力為26 U/mL，比優(yōu)化前提高了約3倍。

3 結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)是雞糞的主要物質(zhì)之一，其中粗蛋白含量為25%～35%[14]，本研究以篩選具有降解蛋白質(zhì)功能的細(xì)菌為目的，在雞糞發(fā)酵高溫期時(shí)(≥50 ℃)篩選到11株高溫菌株，確定了1株高溫細(xì)菌(GX7)具有較高蛋白酶活力，經(jīng)過(guò)16S rDNA測(cè)序并進(jìn)行同源性比較可知，GX7與枯草芽孢桿菌的16S rDNA序列相似性達(dá)到100%，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并結(jié)合生理生化試驗(yàn)，鑒定GX7為枯草芽孢桿菌。

本研究確定了酶活力與菌數(shù)的關(guān)系，優(yōu)化培養(yǎng)基提高菌數(shù)的同時(shí)也提高蛋白酶活力。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，活菌數(shù)由0.85×108cfu/mL提高至2.56×109cfu/mL，蛋白酶活力由9 U/mL提高至26 U/mL，提高了約3倍。有效菌數(shù)多可以抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，在雞糞發(fā)酵時(shí)解決了其他有害雜菌過(guò)多的問(wèn)題，而且能提高發(fā)酵效率，縮短雞糞發(fā)酵時(shí)間；同時(shí)，蛋白酶活力的提高更有利于雞糞中蛋白質(zhì)的分解，能夠提高發(fā)酵后的有效肥效，增加肥力。本研究為進(jìn)一步研究高溫蛋白質(zhì)降解菌的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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Screening and Identification of A High Temperature Resistance Protease-producing Bacteria and Optimization of Its Liquid Fermentation Condition

AO Jing,HUAN Minghui,LI Yang,LIU Xiaohui,GAO Xiaomei,XU Chong

(Microbial Research Institute of Liaoning Province,Chaoyang 122000,China)

To improve chicken manure fermentation,11 strains were screened in chicken manure fermentation during the period of high temperature(≥50 ℃),of which thermophilic bacteria GX7 with high protease activity by 16S rDNA sequencing and homology comparison,the sequence homology of GX7 withBacillussubtilisof 100%.GX7 was identified asBacillussubtilisby phylogenetic tree and combined with physiological and biochemical tests.By drawing the bacterial growth curve and determining the bacterial protease activity,it could be known that the protease activity of GX7 was strongly positively correlated with the number of bacteria.By optimization of culture medium composition and strain culture conditions,the optimal medium was yeast extract of 1.5%,corn powder of 1.5%,MgSO4of 0.5%;The optimum culture condition was pH value of 8.1,culture temperature of 37 ℃,inoculation amount of 2%,liquid volume of 50 mL(250 mL),shaker speed of 140 r/min.Under these conditions,the number of viable bacteria increased 10 times to 2.56×109cfu/mL,and the protease activity increased three times to 26 U/mL.

high temperature; protease; bacteria; identification; fermentation condition optimization

2016-05-01

敖 靜(1986-)女，遼寧朝陽(yáng)人，助理研究員，本科，主要從事微生物菌種選育工作。E-mail：aojing07@163.com

S811.7

A

1004-3268(2016)11-0116-07