菊芋葉片提取物對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌效果及盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)

李屹　韓?！⊥觖惢邸〉?/p>

摘要：采用生長(zhǎng)速率法，對(duì)菊芋葉片5種溶劑提取物進(jìn)行辣椒疫霉菌抑菌效果試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌均具有抑菌效果，石油醚和乙酸乙酯為溶劑的菊芋葉片提取物12.5 mg/mL對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌率最高，達(dá)到100.00%；在各溶劑提取物不同濃度梯度情況下，乙酸乙酯提取物的抑菌效果最為顯著，當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，抑菌率已達(dá)到100.00%，濃度降到2.5 mg/mL時(shí)，抑菌率為（27.91±2.076）%，顯著高于同濃度其他溶劑的提取物。對(duì)菊芋葉片乙酸乙酯提取物50倍液進(jìn)行防治辣椒疫病的盆栽試驗(yàn)，結(jié)果表明，其對(duì)辣椒疫病的防治效果達(dá)到10000%，優(yōu)于化學(xué)藥劑25%甲霜靈可濕性粉劑 400倍液的防治效果。

關(guān)鍵詞：菊芋；提取物；辣椒；疫霉菌；抑菌效果；石油醚；乙酸乙酯

中圖分類(lèi)號(hào)： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0139-02

收稿日期：2014-04-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：CARS-25-G-49）。

作者簡(jiǎn)介：李屹（1973—），女，河南鞏義人，研究員，主要從事蔬菜病蟲(chóng)害防治。Tel：（0971）5311167；E-mail：ly525414@sina.com。辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染引起的一種毀滅性真菌性病害，于1918年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，迄今已在世界各地的辣椒種植區(qū)普遍發(fā)生[1]。在20世紀(jì)50年代，我國(guó)最早在江蘇發(fā)現(xiàn)辣椒疫病，目前該病已危及我國(guó)的青海、新疆、上海、北京、陜西、貴州、四川等許多地區(qū)[2-8]，并呈逐年加重趨勢(shì)，給辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，是辣椒的主要病害之一。辣椒疫病是一種土傳病害，可經(jīng)雨水、土壤、氣流等多種途徑傳播，發(fā)病時(shí)可造成莖稈壞死、葉片枯萎、果實(shí)腐爛，甚至整株萎蔫死亡，從而導(dǎo)致田間大面積出現(xiàn)死秧[9]。利用化學(xué)藥劑防治辣椒疫病效果甚微，且容易造成環(huán)境污染，開(kāi)發(fā)無(wú)害、高效的新型生物農(nóng)藥是當(dāng)前病害防治的發(fā)展方向。本試驗(yàn)采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇共5種溶劑，對(duì)菊芋葉片的有效成分進(jìn)行提取，對(duì)提取物進(jìn)行辣椒疫霉菌抑菌效果試驗(yàn)，確定最佳溶劑，并開(kāi)展辣椒盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)，為利用菊芋開(kāi)發(fā)高效、安全的新型無(wú)公害植物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菊芋葉片不同溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌的室內(nèi)抑菌效果

1.1.1供試樣品供試植物為菊芋，種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，鮮葉于秋季霜前采集，室內(nèi)自然陰干，用粉碎機(jī)粉碎制成植物干粉，密封于塑料袋中備用。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑真菌培養(yǎng)基為 PDA 培養(yǎng)基；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇等生化試劑均為分析純，市購(gòu)。

1.1.3供試菌種辣椒疫霉菌菌種由青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，將菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，25 ℃培養(yǎng)2～3 d；活化菌株轉(zhuǎn)接到PDA固體平板上，25 ℃ 培養(yǎng)2～5 d，至菌絲覆蓋整個(gè)平板。

1.1.4菊芋葉片不同提取物的制備5種溶劑提取物提取方法分別為：分別稱取菊芋葉片干粉材料2、1.2、2.4、2、3 kg，分別加入乙醇10 L、氯仿6 L、乙酸乙酯12 L、丙酮10 L、石油醚15 L，浸提2次，浸提2 d；合并2次浸提液，減壓濃縮，分別得到菊芋葉片乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和石油醚粗提物。

1.1.5菊芋葉片提取物的抑菌活性測(cè)定將各粗提物配制成一定濃度；一方面分別取一定量各溶劑提取物加入到溫度40 ℃左右、已熔化的PDA固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，使菊芋葉片提取物在PDA培養(yǎng)基中終濃度為 12.5 mg/mL，以添加相對(duì)應(yīng)的有機(jī)溶劑為對(duì)照，另一方面使各菊芋葉片提取物在PDA培養(yǎng)基中的終濃度分別為25、20、15、12.5、10、7.5、5、2.5 mg/mL；待培養(yǎng)基凝固，于中央接入直徑為9 mm 的辣椒疫霉菌菌塊，于25 ℃培養(yǎng)72 h，“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落純生長(zhǎng)量和抑菌率：純生長(zhǎng)量=菌落平均直徑-菌餅直徑；抑菌率=（對(duì)照純生長(zhǎng)量-處理純生長(zhǎng)量）/對(duì)照純生長(zhǎng)量×100%。

1.1.6數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)用Excel和DPS軟件進(jìn)行分析處理。

1.2盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)

1.2.1供試材料供試?yán)苯菲贩N為樂(lè)都長(zhǎng)辣椒；供試試劑為菊芋葉片乙酸乙酯粗提物和25%甲霜靈可濕性粉劑。

1.2.2試驗(yàn)方法辣椒采用盆栽，每盆栽種辣椒3株，在辣椒8～10葉期處理；試驗(yàn)設(shè)菊芋葉片粗提物50倍液、25%甲霜靈可濕性粉劑 400倍液、清水處理為空白對(duì)照共3個(gè)處理，采用灌根方式，沿每株辣椒根部灌入10 mL試劑或清水；24 h后使用注射器吸取游動(dòng)疫霉菌孢子濃度為1×104個(gè)/mL 的懸浮液5 mL，注入離辣椒幼苗根莖約2 cm處，保持土壤濕度飽和、溫度為25 ℃左右。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)用辣椒5盆。孢子懸浮液制備方法為：將在CN培養(yǎng)基上培養(yǎng)的疫霉菌單孢純化菌株，于28 ℃條件下連續(xù)光照培養(yǎng)5～7 d以形成大量孢子囊；挑取產(chǎn)生孢子囊的菌絲塊放入試管中，加入無(wú)菌水20 mL，放入4 ℃冰箱中預(yù)冷1 h，移至室溫20 min，振蕩即得游動(dòng)孢子懸浮液，用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋調(diào)節(jié)。

1.2.3調(diào)查內(nèi)容及統(tǒng)計(jì)方法分別于施藥后7、14、21 d調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果，計(jì)算公式：發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。病情指數(shù)DI：DI=∑（s×n）/（N×5）×100%，式中，s為各病情級(jí)別的代表數(shù)值；n為各病情級(jí)別的植株數(shù)；N為調(diào)查總植株數(shù)。防治效果=（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-防治區(qū)病情指數(shù)）/防治區(qū)病情指數(shù)×100%。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)：無(wú)??；1級(jí)：幼苗根莖部輕微變黑，葉片不萎蔫或可恢復(fù)性萎蔫；2級(jí)：幼苗根莖部變黑1～2 cm，葉片不可恢復(fù)性萎蔫，下部葉片偶有脫落；3級(jí)：幼苗根莖部變黑超過(guò)2 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；4級(jí)：幼苗根部變黑縊縮，除生長(zhǎng)點(diǎn)外全部落葉或整株萎蔫；5級(jí)：植株枯死。

2結(jié)果與分析

2.1菊芋葉片不同溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌效果

由表1可知，菊芋葉片各溶劑提取物12.5 mg/mL處理，辣椒疫霉菌的菌絲純生長(zhǎng)量與對(duì)照處理相比，均存在顯著差異，各溶劑提取物對(duì)真菌生長(zhǎng)均起到一定的抑制作用；石油醚、乙酸乙酯提取物對(duì)辣椒疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率達(dá)到100.00%，顯著高于其他提取物處理；丙酮提取物次之，抑菌率為（27.51%±2.823）%；乙醇提取物對(duì)疫霉菌抑菌效果相對(duì)最差，抑菌率僅為（3.99±1.009）%。

表1菊芋葉片不同溶劑提取物12.5 mg/mL對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌效果

溶劑純生長(zhǎng)量（cm）菊芋葉片提取物僅溶劑（對(duì)照）抑菌率

（%）石油醚0±0e1.35±0.089100.00±0a乙酸乙酯0±0e5.20±0.347100.00±0a氯仿13.92±0.454c17.20±0.32719.10±1.282c丙酮5.25±0.278d7.24±0.10627.51±2.823b乙醇32.22±0.202b33.56±0.5443.99±1.009d空白對(duì)照45.20±0.700a注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

由表2可知，乙酸乙酯提取物對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌效果最為顯著，當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，抑菌率達(dá)100.00%，當(dāng)濃度降到2.5 mg/mL時(shí)，抑菌率為（27.91±2.076）%；石油醚提取物的抑菌效果次之，濃度為7.5 mg/mL時(shí)，抑菌率達(dá)10000%，當(dāng)濃度逐漸降低時(shí)，抑菌率也顯著降低；氯仿提取物和丙酮提取物在2.5～10 mg/mL時(shí)的抑菌效果相差不大，濃度大于10 mg/mL時(shí)，丙酮提取物的抑菌效果增加程度明顯大于氯仿，在20 mg/mL時(shí)，丙酮提取物的抑菌率達(dá)10000%，氯仿提取物在25 mg/mL時(shí)抑菌率才達(dá)到100.00%；乙醇提取物的抑菌效果最差，濃度小于10 mg/mL幾乎沒(méi)有抑菌效果，當(dāng)濃度大于12.5 mg/mL時(shí)，抑菌率隨濃度的增加而增大，當(dāng)濃度為 25 mg/mL 時(shí)，抑菌率為（72.43±0.472）%。表2不同溶劑

2.2菊芋葉片提取物防治辣椒疫病盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)

由表3可知，施藥后7 d，菊芋葉片粗提物50倍液及25%甲霜靈可濕性粉劑 400倍液2個(gè)處理均未發(fā)病，清水對(duì)照發(fā)病率達(dá)17.78%、病情指數(shù)達(dá)4.00%；施藥后14 d，菊芋葉片粗提物50倍液處理的辣椒未發(fā)病，25%甲霜靈可濕性粉劑 400倍液處理的辣椒發(fā)病率為8.89%、病情指數(shù)為178%，清水對(duì)照發(fā)病率達(dá)37.78%、病情指數(shù)達(dá)14.67%；施藥后 21 d，菊芋葉片粗提物50倍液處理的辣椒仍未發(fā)病，25%甲霜靈可濕性粉劑 400倍液處理的辣椒發(fā)病率為13.33%、病情指數(shù)為4.89%，病情發(fā)展較為緩慢，清水對(duì)照發(fā)病率達(dá)到57.78%、病情指數(shù)達(dá)到35.11%。菊芋葉片提取物50倍液處理的辣椒全程無(wú)疫病發(fā)生，對(duì)辣椒疫病有較好的防治效果。表3菊芋葉片提取物對(duì)辣椒疫病的防治效果

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，菊芋葉片不同提取物對(duì)辣椒疫霉菌均具有抑菌效果，溶劑提取物濃度為12.5 mg/mL時(shí)，石油醚和乙酸乙酯提取物對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌率達(dá)到100.00%，顯著高于其他提取物；乙酸乙酯提取物的抑菌效果最為顯著，當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，抑菌率達(dá)到100.00%， 濃度降到2.5 mg/mL時(shí)， 抑菌率尚有（27.91±2.076）%，顯著高于同濃度其他溶劑提取物；菊芋葉片乙酸乙酯提取物50倍液對(duì)辣椒疫病具有良好的防治效果，藥后21 d防效仍達(dá)到100.00%，優(yōu)于化學(xué)藥劑25%甲霜靈可濕性粉劑 400倍液的防治效果。

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著十分重要的作用。隨著人們健康意識(shí)的提高，農(nóng)藥殘留超標(biāo)已成為嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥已成當(dāng)務(wù)之急[10]。植物源農(nóng)藥來(lái)源于自然，具有環(huán)保、長(zhǎng)效、易光解、無(wú)殘留等特點(diǎn)，能保持農(nóng)產(chǎn)品的高品質(zhì)， 是發(fā)展有機(jī)農(nóng)業(yè)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的理想農(nóng)藥。菊科植物是最重要的植物源農(nóng)藥來(lái)源，在有殺蟲(chóng)活性的1600種植物中，有1/10是菊科

植物[11]。研究表明，菊芋能抵御多種植物疾病，極少蟲(chóng)害，含有抗蟲(chóng)抑菌活性物質(zhì)，具有耐旱、耐寒、耐鹽及抗病蟲(chóng)害等特點(diǎn)[12]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菊芋用于治理沙漠和深加工方面的研究較多，有關(guān)菊芋葉片生物活性物質(zhì)及其抑菌活性的研究較少。韓睿等已經(jīng)開(kāi)展菊芋葉片有效成分提取分離技術(shù)研究[13]。通過(guò)本試驗(yàn)，證明了菊芋提取液對(duì)辣椒疫霉菌具有很好的抑制作用，這對(duì)于充分利用菊芋資源、開(kāi)發(fā)研制新型植物源殺菌劑、拓展菊芋的應(yīng)用領(lǐng)域提供了一定的依據(jù)。在盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)中，只設(shè)定了1個(gè)提取液濃度，不能更為客觀地分析其防治效果，有必要在后續(xù)試驗(yàn)中設(shè)計(jì)更多的濃度梯度，進(jìn)一步確定菊芋提取液對(duì)辣椒疫病的防治效果及最佳防治濃度。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱宗源，陸金萍，周新根，等. 上海郊區(qū)青椒疫病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1992，8（3）：36-41.

[2]陳堅(jiān)忠. 青海高海拔地區(qū)辣椒疫病的發(fā)生及防治措施[J]. 作物雜志，2008（4）：83-84.

[3]程沄，沈崇堯，段道懷. 青椒疫菌為北京地區(qū)青椒死秧的主要原因[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，1988，18（1）：9-14.

[4]王志田，史載誠(chéng)，趙林忠，等. 哈密地區(qū)辣椒疫霉菌的鑒定及部分生物學(xué)測(cè)定[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990（2）：69-71.

[5]王燕華，楊順寶. 上海地區(qū)甜椒疫病菌的鑒定[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技，1982（1）：20-21.

[6]常彩濤，鞏振輝，王鳴. 陜西辣椒疫病菌種的鑒定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1993，2（1）：87-90.

[7]楊學(xué)輝，袁潔，謝海呈. 貴州省辣椒主栽品種抗疫病性鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，18（6）：791-793.

[8]彭化賢，劉波微，李薇. 四川辣椒疫霉菌生物學(xué)特性和辣椒抗霉疫病性鑒定方法初探[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，20（1）：140-144.

[9]易圖永，謝丙炎，張寶璽，等. 辣椒疫病防治研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)蔬菜，2002（5）：52-55.

[10]吳光旭，何庭玉，劉愛(ài)媛，等. 植物中抗病原真菌的活性物質(zhì)[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2004，21（3）：367-375.

[11]李云壽，鄒華英，唐紹宗，等. 14種菊科植物提取物對(duì)菜青蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性[J]. 華東昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2000，9（2）：99-101.

[12]Stanley J K，Nottingham S F. Biology and chemistry of Jerusalem artichoke[M]. New York：CRC Press，2008.

[13]韓睿，王麗慧，鐘啟文，等. 菊芋葉片提取物抑菌活性研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（5）：120-123.高宇，王志英，趙紅盈，等. 白蠟吉丁嚙小蜂雌蜂對(duì)寄主揮發(fā)物的觸角電位和行為反應(yīng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：141-143.