靶向樹突狀細(xì)胞的呼吸道合胞病毒F重組蛋白的構(gòu)建與體外活性分析

華 穎,彭向雷,付遠(yuǎn)輝,鄭妍鵬,洪 濤,何金生

(北京交通大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044)

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靶向樹突狀細(xì)胞的呼吸道合胞病毒F重組蛋白的構(gòu)建與體外活性分析

華 穎,彭向雷,付遠(yuǎn)輝,鄭妍鵬,洪 濤,何金生

(北京交通大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044)

分析以人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)融合糖蛋白(fusion glycoprotein, F)為抗原靶向DEC205/CD205受體策略對(duì)重組F蛋白表達(dá)及活性的影響.F蛋白是RSV的重要中和抗原，克隆RSV F蛋白胞外區(qū)的編碼基因至可識(shí)別鼠樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)DEC205受體的單鏈抗體(single chain antibody of anti-DEC205, scDEC)的C端，構(gòu)建可表達(dá)重組F蛋白(scDECF)的質(zhì)粒pVAX1/scDECF，Western blot方法檢測(cè)scDECF的表達(dá)，免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)的scDECF與DEC205受體的結(jié)合活性.經(jīng)Western blot 證實(shí)在pVAX1/scDECF轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞成功表達(dá)了scDECF.將所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)上清與表達(dá)鼠DEC205受體的細(xì)胞CHOmDEC205孵育，用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)：與作為對(duì)照的重組F蛋白scISOF相比，所獲得的scDECF與CHOmDEC205細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的結(jié)合.本研究成功表達(dá)了重組蛋白scDECF，且所獲得的重組蛋白scDECF具有與表達(dá)DEC205受體的細(xì)胞特異性結(jié)合的活性.關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒；融合糖蛋白；DEC205；樹突狀細(xì)胞； 靶向疫苗

呼吸道合胞病毒(Respiratogy syncytial virus, RSV)是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染的最重要的病毒病原，人群對(duì)RSV普遍易感且可反復(fù)感染[1].RSV感染可導(dǎo)致移植患者、免疫力缺陷人群及老年人呼吸道疾病的發(fā)病率及死亡率增加[2].早期的RSV疫苗臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，福爾馬林滅活的RSV疫苗(Formalin-inactivated RSV, FI-RSV)免疫的嬰幼兒再次感染RSV時(shí)會(huì)發(fā)生更加嚴(yán)重的下呼吸道感染、甚至死亡[3].隨后，盡管有亞單位疫苗、多肽疫苗、裸DNA疫苗、病毒載體疫苗以及減毒活疫苗等多種形式的RSV疫苗在研制，但目前仍沒有安全、有效的RSV疫苗問世.

RSV是有包膜的、單股負(fù)鏈RNA病毒，病毒基因組編碼11種蛋白，其中病毒顆粒表面的Ⅰ型跨膜融合糖蛋白是主要的交叉保護(hù)性抗原和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的靶抗原[4].F蛋白由574個(gè)氨基酸組成，首先被合成為無活性的前體形式F0，有N連接的糖基化修飾[5].三個(gè)F0單體組裝成一個(gè)三聚體經(jīng)高爾基體時(shí)分別被弗林酶兩次切割，產(chǎn)生的F2和F1通過二硫鍵連接，形成有功能的F蛋白三聚體[6].融合前形式的F蛋白三聚體處于亞穩(wěn)態(tài)，易觸發(fā)再折疊形成融合后形式的F蛋白，并導(dǎo)致膜融合[5].融合前形式的F蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體.基因形式的RSV F疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)F蛋白融合前構(gòu)象特有的φ表位的抗體，其中和活性是帕利珠單克隆抗體的50倍[7].

因此，用可表達(dá)RSV F蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)F蛋白，能避免蛋白純化過程對(duì)F蛋白構(gòu)象造成的影響，且有利于產(chǎn)生針對(duì)融合前構(gòu)象特有的φ表位的抗體.另一方面，樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者[8].通過靶向DCs表面的特異性的膜分子，如DEC205、DC-SIGN(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin)、PD-1(programmed death-1)等可增強(qiáng)DCs對(duì)抗原的攝取、加工和提呈能力，將目的抗原靶向DCs的策略應(yīng)用于疫苗研究，能提高疫苗的細(xì)胞免疫及體液免疫效果[8-10]. 基于以上分析，我們將編碼RSV F蛋白胞外區(qū)的基因與可識(shí)別DCs表面的DEC205受體的單鏈抗體的編碼基因進(jìn)行融合，構(gòu)建了可用于真核細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒pVAX1/scDECF.以期實(shí)現(xiàn)將RSV F蛋白成功靶向DCs細(xì)胞的目的，并增強(qiáng)DCs對(duì)F蛋白的加工及其向T細(xì)胞呈遞能力，從而提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒pVAX1、Top10菌株、293T、CHO細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，pcDNA3.1+/F質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，含有anti-DEC205、ISO單克隆抗體輕鏈、重鏈基因的質(zhì)粒及CHOmDEC205細(xì)胞株由美國洛克菲勒大學(xué)Ralph M. Steinman教授饋贈(zèng).DNA Marker DL2000、DL15000、T4 DNA連接酶、Prime STARTM HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司；蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen；山羊抗人RSV多抗、RSV F單抗(131-2A)購自Millipore公司；β-actin抗體、TRITC標(biāo)記兔抗山羊二抗購自博奧森公司; Hochest33342購自碧云天公司.

1.2 引物設(shè)計(jì)

參照anti-DEC205、對(duì)照抗體(ISO)重鏈及輕鏈的序列[11]，用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物(見表1)，分別擴(kuò)增anti-DEC205重鏈及輕鏈的可變區(qū)、ISO重鏈及輕鏈的可變區(qū).用重疊延伸PCR的方法分別連接兩個(gè)單鏈抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)，獲得scDEC、scISO.重鏈、輕鏈間的linker為 (G4S)4，單鏈抗體與目的抗原之間linker為GS(G4S)4GS，引物由南京金斯瑞公司合成.

1.3 scDEC、scISO單鏈抗體基因片段的獲得

分別用PCR方法從含有anti-DEC205重鏈、anti-DEC205輕鏈的質(zhì)粒擴(kuò)增重鏈及輕鏈可變區(qū)，重疊延伸PCR連接重鏈、輕鏈可變區(qū)，獲得anti-mouse DEC205單鏈抗體基因片段(ScDEC).膠回收試劑盒回收產(chǎn)物.用同樣方法獲得靶向?qū)φ誌SO單鏈抗體基因片段(ScISO).

1.4 RSV F蛋白胞外區(qū)基因的擴(kuò)增

以pcDNA3.1+/F質(zhì)粒為模板，采用PCR方法擴(kuò)增RSV F蛋白胞外區(qū)基因.DNA片段純化試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物.

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及核酸序列分析鑒定

用重疊延伸PCR方法分別將ScDEC、ScISO單鏈抗體與RSV F胞外區(qū)基因相連接.膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，經(jīng)EcoRⅠ/NotⅠ酶切純化后與經(jīng)同樣酶切處理的pVAX1載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)中，雙酶切篩選陽性克隆并由華大基因測(cè)序鑒定.獲得重組質(zhì)粒pVAX1/scDECF、pVAX1/scISOF.

表1 擴(kuò)增scDEC、scISO、目的基因及質(zhì)粒構(gòu)建所用引物

注：1: DEC-VH; 2: DEC-VH linker; 3: scDEC; 4: ISO-VH; 5: ISO-VH linker; 6: scISO; 7: The extracellular region of RSV F

1.6 重組蛋白的表達(dá)鑒定

取質(zhì)粒pVAX1/scDECF、pVAX1/scISOF分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h分別收獲上清.收獲的上清用于蛋白表達(dá)鑒定.將細(xì)胞培養(yǎng)上清凍干濃縮10倍后取15 μl上樣做SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用Western blot方法分析蛋白表達(dá).一抗為山羊抗人RSV多抗(1∶3 000稀釋)，二抗為兔抗山羊HRP標(biāo)記(1∶5 000稀釋).

1.7 重組蛋白的活性鑒定

1.7.1 免疫熒光方法

取質(zhì)粒pVAX1/scDECF、pVAX1/scISOF分別轉(zhuǎn)染293T收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別與生長(zhǎng)在96孔板上的CHO、CHOmDEC205細(xì)胞4℃孵育30 min(每孔加入200 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清)，PBS清洗3次，加入山羊抗人RSV多抗(1∶480稀釋)，37℃ 1 h，PBS清洗3次，加入二抗，兔抗羊羅丹明標(biāo)記的抗體(1∶200稀釋)，PBS清洗3次，加入Hochest 33 342，室溫10 min，PBS清洗2次，去離子水清洗1次，熒光顯微鏡下觀察.

1.7.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

獲取重組目的蛋白方法同上，將上清分別與CHO、CHOmDEC205細(xì)胞4℃孵育30 min，PBS清洗3次，加入RSV F單抗(131-2A)，4℃ 避光孵育30 min，PBS清洗3次，加入PE標(biāo)記二抗，4℃ 避光孵育30 min，PBS清洗3次，300 μl PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 ScDEC、ScISO單鏈抗體及RSV F蛋白胞外區(qū)的PCR克隆

scDEC及scISO單鏈抗體的連接方式如圖1所示.將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，成功獲得了scDEC205單鏈抗體的重鏈可變區(qū)、scDEC205單鏈抗體的輕鏈可變區(qū).進(jìn)一步用重疊延伸PCR連接重鏈、輕鏈的可變區(qū)，獲得SCDEC單鏈抗體.用同樣的方法獲得靶向?qū)φ誷cISO單鏈抗體的重鏈可變區(qū)、scISO單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)、scISO單鏈抗體.以pcDNA3.1+/F質(zhì)粒為模板，用PCR方法擴(kuò)增獲得RSV F蛋白的胞外區(qū)，見圖2.

2.2 DEC205/ISO單鏈抗體和RSV F胞外區(qū)融合重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

pVAX1/scDECF、pVAX1/scISOF質(zhì)粒構(gòu)建參見示意圖(圖3).經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)EcoR Ⅰ and Not Ⅰ雙酶切產(chǎn)物獲得酶切陽性質(zhì)粒pVAX1/scDECF(圖4(a))，經(jīng)測(cè)序分析比對(duì)為正確質(zhì)粒.用同樣方法構(gòu)建獲得靶向?qū)φ召|(zhì)粒pVAX1/scISOF(圖4(b)).

2.3 重組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)及鑒定

用Western blot方法檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，為鑒定重組蛋白的表達(dá)情況及重組蛋白表達(dá)后能否被RSV多克隆抗體所識(shí)別，分別用質(zhì)粒pVAX1/scDECF 、pVAX1/scISOF瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分別收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清作Western blot分析.重組蛋白在非還原條件下(保持F蛋白內(nèi)部F1、F2之間二硫鍵的連接)，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，加入特異性識(shí)別RSV抗原的山羊抗人RSV多抗做為一抗，HRP標(biāo)記兔抗山羊抗體作為二抗.在目的條帶位置均可檢測(cè)到87 kDa的蛋白，大小與預(yù)期相符，表明重組蛋白scDECF、scISOF在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)(圖5).

2.4 重組蛋白結(jié)合活性的鑒定

2.4.1 免疫熒光方法

為驗(yàn)證目的蛋白scDECF與表達(dá)鼠DEC205受體的CHO細(xì)胞株即CHOmDEC205的結(jié)合能力，我們分別收集pVAX1/scDECF及pVAX1/scISOF 兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后的上清，經(jīng)與表達(dá)有DEC205受體的細(xì)胞株CHOmDEC205在4℃孵育30 min后進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè).在孵育后，與CHOmDEC205細(xì)胞表面的DEC205受體結(jié)合的蛋白能被一抗(山羊抗人RSV多抗)特異性結(jié)合，在加入二抗后即可被檢出呈現(xiàn)紅色熒光.從圖6可以看出，只有pVAX1/scDECF/CHOmDEC205組在熒光顯微鏡下可見到明顯紅色熒光(圖6(a)白色箭頭指示)，其它組均未檢測(cè)到熒光，結(jié)果說明表達(dá)的scDECF重組蛋白具有與DEC205受體特異性結(jié)合的活性.

2.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

將收獲的細(xì)胞上清分別與CHOmDEC205、CHO細(xì)胞孵育后加入相應(yīng)的檢測(cè)抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：CHOmDEC205、CHO細(xì)胞分別與scDECF、scISOF孵育后，檢測(cè)到散點(diǎn)圖中：scDECF-CHOmDEC205細(xì)胞群較scISOF-CHOmDEC205細(xì)胞群顯著上移(陽性細(xì)胞群所占比例，scDECF：26.83%，如圖7(a)所示；scISOF：0.08%，如圖7(c)所示).scDECF-CHO與scISOF-CHO散點(diǎn)圖中細(xì)胞群位置無明顯變化(如圖7(b、d)所示)，陽性細(xì)胞群所占比例均小于1%.結(jié)果說明scDECF與CHOmDEC205細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的結(jié)合.

3 討論

RSV F/G DNA疫苗具有在細(xì)胞內(nèi)從頭合成相應(yīng)抗原的特性，像自然感染一樣，能誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1/Th2平衡的免疫反應(yīng)，以及有效的中和抗體及細(xì)胞免疫，而且在RSV攻毒后不會(huì)引起疾病增強(qiáng)作用等多種優(yōu)點(diǎn)[12-13]，但免疫原性不足是其存在的主要問題[14]，因此，為增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性，我們嘗試將靶向DEC205提高疫苗免疫原性的策略應(yīng)用于RSV DNA疫苗研究.

1)構(gòu)建了可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組融合蛋白scDECF的質(zhì)粒pVAX1/scDECF：用PCR方法擴(kuò)增目的基因、重疊延伸PCR方法連接DEC205單鏈抗體與目的基因F片段，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定篩選陽性克隆，并經(jīng)測(cè)序分析驗(yàn)證所獲得質(zhì)粒的序列與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完全相符.

2)重組融合蛋白scDECF在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)：通過Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定表達(dá)的重組蛋白，一抗用的是RSV多抗，結(jié)果顯示：在87 kDa處檢測(cè)到條帶，與目的蛋白大小相符，且該重組蛋白中的F蛋白能與羊抗人RSV多抗特異性結(jié)合，說明該融合蛋白具有良好的免疫原性.

3)重組蛋白靶向結(jié)合DEC205受體的活性鑒定：首先，我們以間接免疫熒光方法進(jìn)行定性分析，分別將質(zhì)粒pVAX1/scDECF、pVAX1/scISOF轉(zhuǎn)染細(xì)胞所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)上清與CHOmDEC205細(xì)胞孵育，檢測(cè)用的一抗是山羊抗人RSV多抗，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該重組蛋白能與CHOmDEC205發(fā)生特異性結(jié)合，表明重組蛋白中的DEC205單鏈抗體具有與DEC205受體特異性結(jié)合的活性，同時(shí)也再次顯示這一重組蛋白保持了RSV F蛋白的抗原性.另外，本研究圖6中不是所有的細(xì)胞均呈現(xiàn)紅色熒光，分析這可能是由于我們加入的細(xì)胞培養(yǎng)上清體積僅為200 μl(因用96孔板檢測(cè)，加入細(xì)胞培養(yǎng)上清的體積有限)，而且所用的細(xì)胞培養(yǎng)上清為質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所獲得，上清中含有的目的蛋白的濃度較低，因此，實(shí)驗(yàn)體系中能與CHOmDEC205結(jié)合的目的蛋白總量不足；隨后，我們用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量分析，檢測(cè)用的一抗是RSV F單抗，然后用相應(yīng)的PE標(biāo)記的二抗，結(jié)果顯示：scDECF與CHOmDEC205細(xì)胞共培養(yǎng)組中的陽性細(xì)胞群所占比例為26.83%，遠(yuǎn)高于scISOF與CHOmDEC205細(xì)胞共培養(yǎng)組中的0.08%，說明scDECF與CHOmDEC205細(xì)胞發(fā)生了特異性地結(jié)合.以上的研究與HIV靶向DC的DNA疫苗的體外研究[15]取得了一致的結(jié)果，在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了通過靶向DEC205可以實(shí)現(xiàn)DCs對(duì)RSV F抗原的高效攝取.

4 結(jié)論與展望

獲得可靶向DCs細(xì)胞的RSV F重組蛋白scDECF，且在體外具有與DEC205受體特異性結(jié)合的活性.由于通過DCs表面的受體DEC205(又稱CD205受體，負(fù)責(zé)抗原的內(nèi)吞和提呈)能將目的抗原選擇性地高效靶向DCs，顯著增強(qiáng)疫苗的免疫原性，有效地將抗原遞呈給MHC I和II類分子，誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的保護(hù)性的T細(xì)胞免疫和體液免疫[15-16].據(jù)此分析pVAX1/scDECF在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)：目的蛋白不僅能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而且DCs靶向的蛋白可與DEC205受體特異性結(jié)合，也增強(qiáng)了DCs攝取F蛋白的能力，以及DCs對(duì)抗原的交叉提呈[17]，從而增強(qiáng)疫苗的體液免疫及細(xì)胞免疫效果.

目前的研究?jī)H展示了pVAX1/scDECF在體外實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，下一步將開展體內(nèi)研究，來檢測(cè)pVAX1/scDECF是否增強(qiáng)RSV DNA疫苗的免疫效果，尤其是CD8+ T細(xì)胞免疫反應(yīng)，為研制RSV DNA疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

致謝:衷心感謝美國洛克菲勒大學(xué)已故Ralph M. Steinman教授贈(zèng)送CHOmDEC205細(xì)胞株及編碼DEC205抗體輕鏈、重鏈基因及其對(duì)照質(zhì)粒，以及美國馬里蘭大學(xué)的XiaoPing Zhu教授在實(shí)驗(yàn)過程中給予的指導(dǎo)和幫助.感謝本研究院的焦月盈博士、馬堯博士等同學(xué)在實(shí)驗(yàn)過程中給予的幫助.

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Construction of respiratory syncytial virus fusion glycoprotein targeting dendritic cells and its in vitro activity analysis

HUAYing,PENGXianglei,FUYuanhui,ZHENGYanpeng,HONGTao,HEJinsheng

(College of Life Sciences & Bioengineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044,China)

This investigation was implemented by fusing the human respiratory syncytial virus (RSV) fusion glycoprotein (F) extracellular domain to DEC205 single chain antibody and detecting the activity of the recombinant protein in vitro. F protein is one important antigen of RSV and targeting F protein to dendritic cells (DCs) may help to enhance the immune efficacy of vaccine. After cloning the gene encoding the extracellular domain of the F protein to 3′ end of the single chain antibody specific for mouse DEC205 receptor, distributed on the surface of mouse dendritic cells, the expression of the recombinant protein scDECF was confirmed by Western blot assay and the DEC205 binding activity was analyzed by immunofluorescence and flow cytometry. Data showed that the recombinant protein scDECF was successfully expressed in eukaryotic cells, and exhibited the specific binding activity to DEC205 receptor on CHOmDEC205 cells.

RSV; fusion glycoprotein; DEC205; DCs; targeted vaccine

1673-0291(2016)06-0127-07

10.11860/j.issn.1673-0291.2016.06.021

2016-08-15

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2009YJS037);國家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)資金資助(2013ZX09103-003-011)

華穎(1972—)，女，黑龍江哈爾濱人，博士生.研究方向?yàn)椴《疽呙?email: yinghua@bjtu.edu.cn.

何金生(1964—)，男，安徽霍邱人，教授，博士，博士生導(dǎo)師.email:jshhe@bjtu.edu.cn.

R392.12

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