抗雛番鴨細小病毒雞源卵黃抗體的制備及保護效果研究

張元元 ， 劉 璐 ， 劉倩宏 ， 蘇友鵬

(吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院 ， 吉林吉林132101)

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抗雛番鴨細小病毒雞源卵黃抗體的制備及保護效果研究

張元元 ， 劉 璐 ， 劉倩宏 ， 蘇友鵬

(吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院 ， 吉林吉林132101)

雛番鴨細小病毒病(MDPVD)，俗稱“三周病”，該病是由番鴨細小病毒引起的3周齡內(nèi)的雛番鴨發(fā)病。病番鴨表現(xiàn)為腳軟、呼吸困難及腹瀉為主要癥狀，該病的死亡率可達40%～50%以上,給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大危害。目前控制本病的方法主要為疫苗免疫接種及一些綜合防制措施，對發(fā)病動物采用番鴨超免卵黃抗體或超免血清作被動免疫，進行緊急治療。但由于鴨源抗體成本較高、來源有限，本研究采用雛番鴨細小病毒滅活苗、弱毒苗聯(lián)合免疫成年產(chǎn)蛋母雞，制備雞源MDPV卵黃抗體，并對制備的卵黃抗體進行評價，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗動物為成年來杭蛋雞(本校雞場)，體重為2kg/只。

1.2 主要試劑 MDPV滅活苗、弱毒苗，均購自科特威生物科技公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑，購自Sigma公司；辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗雞抗體及DAB顯色試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.3 動物免疫及抗體效價檢測 于免疫前3d收集雞蛋作為對照。以MDPV滅活苗(1mL)混合弱毒苗(1頭份/只)首免成年蛋雞，采取胸部肌肉多點注射。一免、二免間隔1周，以后每次免疫間隔10d。二免、三免接種劑量分別為2mL(滅活苗)+10頭份/只(弱毒苗)，3mL(滅活苗)+100頭份/只(弱毒苗)，接種途徑與首免相同。

于三免后開始用中和試驗檢測高免蛋中的抗體效價，待抗體水平上升到一個較高水平時，開始收集高免蛋。

1.4 卵黃抗體制備及純化 將收集的雞蛋用水沖洗干凈后，依次使用碘酒和75%酒精擦拭消毒后，超凈工作臺中無菌分離卵黃，與等體積滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)搗碎勻漿后，參照胡慶松等[1]的硫酸銨鹽析法純化卵黃抗體，無菌操作。

1.5 測定卵黃抗體的中和效價和純度 采用雞胚中和試驗法測定卵黃抗體MDPV的中和效價，同時設(shè)立對照組，觀察雞胚病變及死亡情況，并用統(tǒng)計學方法計算卵黃抗體中和效價。卵黃抗體中殘留的硫酸銨用透析法除去，卵黃抗體純度(純化前、后)檢測采用SDS-PAGE法分析，具體操作參見文獻[1]。

1.6 制備卵黃抗體微生物學及安全性檢測 將卵黃抗體接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，觀察有無細菌生長。抓取雛鴨8只，注射卵黃抗體，每只2 mL。觀察雛鴨食欲、精神狀態(tài)、有無腹瀉等異常反應(yīng)，觀察至72 h后，剖檢雛鴨，觀察實質(zhì)臟器及免疫器官有無病理變化。

1.7 卵黃抗體治療效果觀察 將 20 只3周齡健康雛鴨隨機分成 4 組，I組、II 組、III 組為試驗組，IV 組為對照組，攻毒后隔離飼養(yǎng)。各組肌肉注射病毒液(臨床分離，本室保存)1.0 mL，48 h 后 I、II、III 組每日分別肌肉注射卵黃抗體 0.3、0.5、1.0 mL，連續(xù)注射 3 d，觀察至 14 d分析卵黃抗體不同使用劑量對患鴨的治療效果。

2 結(jié)果

2.1 卵黃抗體效價測定及純度檢測 采用中和試驗測定卵黃抗體中和效價為1∶120，對照組效價為 1∶2?？贵w純度檢測，經(jīng)硫酸銨梯度沉淀后卵黃抗體得到了較好純化。

2.2 卵黃抗體微生物學檢測及安全性檢測 經(jīng)微生物學檢測，平板上無任何菌落生長(圖略)。接種卵黃抗體的雛鴨經(jīng)觀察，無任何異常表現(xiàn)。

2.3 卵黃抗體治療效果檢測 對照組(IV組)的死亡率高達80%，而試驗組的保護率可分別達到40%、80%及100%，當卵黃抗體肌肉注射0.5mL時即可對雛鴨產(chǎn)生較好的治療效果。

3 討論

隨著番鴨在我國流動性的增加，目前該病在很多省份都有流行，是危害番鴨養(yǎng)殖的重要傳染病之一。由于該病由MDPV引起，缺乏有效的治療藥物，主要依靠疫苗緊急免疫接種、高免血清等進行治療。疫苗不能在短時間產(chǎn)生免疫保護，高免血清價格貴，來源不易得，卵黃抗體成為了治療該病的必然選擇。

本研究利用成年產(chǎn)蛋雞作為卵黃抗體的來源，進一步降低了卵黃抗體的價格；產(chǎn)蛋母雞經(jīng)特異性抗原免疫后，可以產(chǎn)生持久性應(yīng)答反應(yīng)，抗體效價可維持數(shù)月之久；卵黃抗體耐酸、耐堿、耐熱，理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，保存方便。

研究采用滅活苗和弱毒疫苗聯(lián)合免疫的方法，結(jié)果表明，此種免疫方法能夠強烈地激發(fā)機體的免疫水平，不僅制備的卵黃抗體效價可以達到較高的水平,而且臨床試驗也取得了較好的治療效果，表明以雞制備MDPV超免卵黃抗體是可行的。

[1] 胡青松，李呂木，張小飛,等.豬流行性腹瀉病毒3種抗原卵黃抗體的制備，西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)[J].2015,11(43),35-40.

[2] 劉倩宏,吳清民,劉紅卿,等.布魯氏菌外膜蛋白OMP25的原核表達與鑒定，中國獸醫(yī)雜志[J].2008，44(8):18-19.

2016-01-08

吉林農(nóng)業(yè)科技學院重點學科培育項目(X068號)資助

張元元(1995-)，女，本科生，就讀于動物科學專業(yè)，E-mail:930076996@qq.com

劉倩宏，E-mail:qianhongliu@126.com

S852.65+9.2

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0529-6005(2016)10-0044-01