正交法優(yōu)選具有抗巴氏桿菌活性黃連的提取工藝

裴青生 ， 曲 徑 ， 殷中瓊

(1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 ， 青海西寧810016 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 四川成都611130)

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正交法優(yōu)選具有抗巴氏桿菌活性黃連的提取工藝

裴青生1， 曲 徑2， 殷中瓊2

(1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 ， 青海西寧810016 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 四川成都611130)

為了篩選出中藥黃連有效部位的最佳提取工藝，以提取物有效部位的浸膏得率與對巴氏桿菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度為綜合考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對提取工藝中的料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間、乙醇濃度4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)選研究。黃連有效部位的最佳提取方法為：70%乙醇，料液比1:12，提取次數(shù)2次，每次1 h。在該工藝條件下進(jìn)行提取，中藥有效部位浸膏得率可以得到最大化保障，對巴氏桿菌的MIC和MBC值均小于等于15.6 mg/mL。

黃連 ； 有效部位 ； 正交試驗(yàn) ； 提取工藝 ； 巴氏桿菌

多殺性巴氏桿菌是一種重要的動物病原菌，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)有較大的危害，可感染各種家畜、家禽及野生動物，引起禽霍亂、豬肺疫、牛羊兔馬及許多野生動物的敗血癥，并多與其他疾病混合感染或繼發(fā)，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要采用抗生素進(jìn)行治療，但隨著抗菌藥物的廣泛不合理應(yīng)用，特別是將抗菌藥物作為抗菌生長促進(jìn)劑以次治療劑量添加到飼料中，使巴氏桿菌表現(xiàn)為耐藥率高、耐藥范圍廣、呈多重耐藥等特點(diǎn)，不僅給治療和控制疾病帶來困難，而且加劇了抗生素在動物體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重危害了動物食品安全[1]。面對人類對健康的關(guān)注度越來越高，家畜家禽養(yǎng)殖行業(yè)中，綠色、無公害、無耐藥性的新抗菌中獸藥將逐步成為市場的主導(dǎo)。據(jù)研究報(bào)道，部分中藥對常見的幾種臨床致病菌有一定的抑制效果[2-3]。本研究前期試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連(RhizomaCoptidis)的有效部位提取物對巴氏桿菌有很好的抑菌效果。為了提高黃連對巴氏桿菌的抑菌活性，本研究對其有效部位的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以便提高中藥有效物質(zhì)的產(chǎn)量，達(dá)到更好的抑菌效果。

目前，在對黃連等中藥的提取工藝研究中，以測定中藥有效成分含量為指標(biāo)的研究較多[6]，以浸膏得率為指標(biāo)的提取工藝研究較少，綜合文獻(xiàn)資料，本研究以溶劑濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間為影響因素，采用正交實(shí)驗(yàn)，以浸膏得率及對巴氏桿菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)為指標(biāo)，根據(jù)綜合指標(biāo)得到最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 藥材 黃連 RhizomaCoptidis(四川，批次080406)，購自成都中藥市場。

1.2 試驗(yàn)菌種 巴氏桿菌Pasteurella(C481)，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系提供。

1.3 主要試劑 無水乙醇、二甲亞砜等，購自成都市科龍化工試劑廠；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 方法

1.4.1 黃連有效部位最佳提取工藝篩選 以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)及提取次數(shù)(D)為考察對象，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4]，擬定各因素的三水平(見表2)，以提取有效物質(zhì)的浸膏得率，MIC和MBC值為綜合考察指標(biāo)，選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，從而篩選出最佳的提取工藝。

按規(guī)定量稱取藥物9份，每份約30 g，分別粉碎并編號1、2、3、4、5、6、7、8、9，精確稱量9份藥物粉末，將藥物粉末于溶媒中加熱回流提取，每組各提取1次，濃縮濾液至糊狀，放入55℃烘箱中3 d，烘干至浸膏狀態(tài)，稱重并計(jì)算得率，封存?zhèn)溆茫謩e重復(fù)9次。

表1 四因素三水平表

1.4.2 黃連對巴氏桿菌的體外藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌懸液的制備：對巴氏桿菌肉湯純培養(yǎng)物進(jìn)行10倍遞減稀釋，平板計(jì)數(shù)后，制成菌懸液,并調(diào)整其濃度約為106cfu/mL(每毫升的菌落形成單位，Colony-formingunits/mL),備用。

抗菌藥液的制備：將黃連的中藥提取物浸膏溶于二甲亞砜中，配制成質(zhì)量濃度為1 g/mL的儲備液，100 ℃高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

藥敏試驗(yàn)：取無菌試管20支，分為試驗(yàn)組和對照組，每組10支。無菌操作吸取l mL肉湯(含10%小牛血清)分別加于試驗(yàn)組10支試管中，吸取已稀釋好的藥物1 mL加入第1管，混勻后依次倍比稀釋至第9管，使終濃度為1.95 mg/mL，第10管不加藥物為對照管。對照組操作同試驗(yàn)組。用微量加樣器取已校正濃度的菌液0.1 mL，依次由低濃度向高濃度加到試驗(yàn)組各管中，混勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后分別觀察細(xì)菌的生長狀況，以渾濁度為指標(biāo)，以對照組為參考對象，檢查試管中有無細(xì)菌生長，以藥物最低濃度管中無細(xì)菌生長者為該試驗(yàn)菌最低抑菌濃度MIC。將MIC測定中判定未生長細(xì)菌的試驗(yàn)組中藥肉湯0.1 mL接種涂布于加小牛血清的營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，以未長細(xì)菌菌落的管內(nèi)藥物濃度為最低殺菌濃度MBC[5]。

2 結(jié)果

2.1 黃連有效部位提取工藝的優(yōu)選 通過對黃連提取物各浸膏得率的計(jì)算，得出每個(gè)正交號的浸膏得率，分別計(jì)算各組試驗(yàn)結(jié)果的綜合平均值K1、K2、K3及極差R1；通過對巴氏桿菌抑菌活性和殺菌活性的測定，得出每個(gè)正交號的MIC、MBC值，以MIC及MBC的和為藥敏試驗(yàn)結(jié)果考察指標(biāo)，分別計(jì)算各組試驗(yàn)結(jié)果的綜合平均值K1′、K2′、K3′及極差R2，并對其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 以浸膏得率和MIC與MBC值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)直觀分析

表3 以浸膏得率和MIC與MBC值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)的方差分析1

4個(gè)因素對黃連提取物得率的影響大小順序?yàn)椋篋>A>C>B，以得率為指標(biāo)的最優(yōu)水平組合為D2A2C1B3，即70%乙醇，料液比為1:12，提取2次，每次1 h。4個(gè)因素對MIC值與MBC值和的影響大小順序?yàn)椋篈>C>B>D，以MIC值與MBC值和為指標(biāo)的最優(yōu)水平組合為D3B3C3A3，即90%乙醇，料液比為1∶12，提取3次，每次2 h。

通過以上分析可知，篩選出的2個(gè)組合，因素水平的不同在于因素A、C、D，即乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)，其對得率影響最大，對藥敏影響很小。綜合以上分析，D2A2C1B3為提取黃連有效部位的最佳提取工藝因素水平組合，即70%乙醇，料液比1:12，提取次數(shù)2次，每次1 h。

2.2 最優(yōu)組合的驗(yàn)證 按最優(yōu)組合對黃連有效部位進(jìn)行提取，重復(fù)3次，計(jì)算每組得率、MIC和MBC值，其結(jié)果見表4。

表4 最佳提取工藝下的黃連提取物對巴氏桿菌的MIC和MBC值

由表4可得出，在最佳提取條件下，3次驗(yàn)證試驗(yàn)的得率非常接近，且均大于正交試驗(yàn)組最高得率，MIC值和MBC值均屬于正交試驗(yàn)中最小值或較小值。由此可知，正交試驗(yàn)篩選出來的提取工藝為最佳工藝，且該提取工藝穩(wěn)定，所得的綜合指標(biāo)評價(jià)最好。

3 討論

本試驗(yàn)主要是以提取物的浸膏得率及其對巴氏桿菌的MIC和MBC值作為評價(jià)指標(biāo)，綜合探討了黃連有效部位的最佳提取工藝方法，為制劑的制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立以及黃連與其他中藥復(fù)方治病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

黃連有效部位提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表明，按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比和溶媒濃度4個(gè)因素的3個(gè)不同水平，分別以有效部位的提取率及其對巴氏桿菌的MIC和MBC值作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，獲得了黃連有效部位的最佳提取工藝。按照中藥提取條件的常規(guī)設(shè)計(jì)[6]，料液比的設(shè)計(jì)為1∶5～30，提取次數(shù)越多提取越充分，而提取時(shí)間、溶媒濃度則與提取物的種類有關(guān)[7-8]。本研究結(jié)果中料液比、提取次數(shù)與常規(guī)提取設(shè)計(jì)相符合，表明了設(shè)計(jì)的合理性。黃連對巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌的殺菌和抑菌結(jié)果表明，其具有較好作用，為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

本研究主要以對巴氏桿菌的抑菌和殺菌活性以及有效部位的得率為指標(biāo)衡量提取方法的優(yōu)越性，客觀上還有其他指標(biāo)可以用來衡量提取工藝，比如主要成分得率、有效部位對其他類型致病菌的抑菌效果等，有關(guān)這部分內(nèi)容以及對其制劑的開發(fā)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立以及確切療效的研究工作正在進(jìn)行中。

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Extraction Technology ofantiPasteurellaactivity ofRhizomaCoptidisby Orthogonal design

PEI Qing-sheng1， QU Jing2， YIN Zhong-qiong2

(1.Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China;2.College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The aim of this study was to screen the best extraction procedure for antiPasteurellaactivity ofRhizomacoptidiseffective parts.The extract yield of effective parts,minimal inhibitory concentration(MIC)of extracts onPasteurellaand the minimum bactericidal concentration(MBC)of extacts onPasteurellawere used as the three indicators for comprehensive evalu-ation.The optimized extraction procedure was screened by orthogonal design with four factors,the solid-liquid ratio,extraction time,time of extractionand concentration of ethanol.Our result showed that the optimized concentration of ethanol was 70%,the solid-liquid ratio was 1:12,and the extraction time was 2 times of,1-hour extraction.In these conditions,Rhizomacoptidiseffective parts are maximum,and MIC and MBC values for pasteurella are less than or equal to 15.6 mg/mL.

Rhizomacoptidis； effective parts ； orthogonal design. ； extraction procedure ；Pasteurella

YIN Zhong-qiong

2015-11-12

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD34B03);四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)(2013TD0015);青海省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013-N-148)

裴青生(1960-)，男，副研究員，本科，主要從事動物生態(tài)養(yǎng)殖相關(guān)技術(shù)研究,E-mail:mkypqs@163.com

殷中瓊，E-mail：yinzhongq@163.com

R282

A

0529-6005(2016)10-0086-03