益生菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性研究進(jìn)展

潘　娜，王　開，胡桂學(xué)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

益生菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性研究進(jìn)展

潘娜，王開，胡桂學(xué)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

益生菌被定義為有益于消費(fèi)者健康的活的微生物，分為乳桿菌類、雙歧桿菌類、革蘭陽性球菌3類。益生菌能夠調(diào)節(jié)緩解乳糖不耐受、腸道菌群平衡、改善腸道功能、促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、降低血清膽固醇[1]及血壓、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能[2]、減少氧化應(yīng)激等發(fā)揮益生作用[3-4]，與人類健康息息相關(guān)。被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品、肉制品、泡菜、飼料、護(hù)膚品等，其代謝產(chǎn)物細(xì)菌素也被用于食物的儲(chǔ)藏[5]。益生菌在食品發(fā)酵和消化道消化過程中，能在不理想的情況下生長(zhǎng)和存活，引起了很多研究者對(duì)其應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的興趣。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌為了適應(yīng)環(huán)境的脅迫會(huì)進(jìn)行應(yīng)激改變，也有些研究者發(fā)現(xiàn)改變益生菌某些基因后，會(huì)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性發(fā)生改變，而益生特性也會(huì)隨之發(fā)生改變。因此，本文就環(huán)境威脅時(shí)益生菌出現(xiàn)的改變及與環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的基因做一綜述。

1　環(huán)境脅迫

1.1鹽脅迫細(xì)胞膜具有可滲透性，環(huán)境滲透壓的改變會(huì)影響細(xì)胞的生理功能，益生菌面臨滲透脅迫時(shí)膜蛋白可直接或間接調(diào)節(jié)細(xì)胞膜對(duì)鹽離子的滲透性，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)外排Na+，阻止Na+的積累，減輕Na+對(duì)菌體細(xì)胞的毒害作用，同時(shí)通過增加對(duì)K+的吸收，恢復(fù)Na+/K+比，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)離子和水濃度，以及吸收和合成相容性物質(zhì)[6]。楊振泉研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鹽（8%）能抑制益生菌的生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)酸減少，而高濃度鹽對(duì)鹽敏感性乳酸菌的抑制是發(fā)酵周期延長(zhǎng)的主要原因，因此提高起始耐鹽性乳酸菌數(shù)量，可以加快高鹽泡菜成熟[7]。Fredericf研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌CTC494在鹽脅迫條件下細(xì)菌素產(chǎn)量會(huì)下降，適量氯化鈉（2.3%～2.5%）能夠刺激LPC010產(chǎn)生細(xì)菌素[8]。烏日娜研究發(fā)現(xiàn)，在分子伴侶蛋白調(diào)控系統(tǒng)中，基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp隨著NaCl濃度升高而上調(diào)，呈正相關(guān)[9]，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

1.2膽鹽脅迫益生菌對(duì)膽鹽的耐受性能夠反應(yīng)出其在腸道中的潛在的存活能力。1.0%～3.0%濃度膽鹽細(xì)菌素濃度較對(duì)照組高，抑菌效果最好。0.2%膽鹽處理90 min為干酪乳桿菌ATCC393膽鹽脅迫的亞適應(yīng)條件。過高濃度膽鹽能使細(xì)胞破裂或凋亡，面對(duì)膽鹽脅迫時(shí)，益生菌能通過膽鹽水解酶、水解泵，產(chǎn)生應(yīng)激蛋白抵抗膽鹽等多種有毒物質(zhì)。Ana實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌CRL1098在膽鹽脅迫時(shí)，25個(gè)蛋白位點(diǎn)發(fā)生差異表達(dá)，膽水解酶BSH基因明顯上調(diào)是細(xì)胞解毒的重要策略[10]。

1.3酸脅迫益生菌通過腸道時(shí)，胃酸是重要的脅迫因素之一。大量研究表明，乳酸菌在pH值5.0～6.5之間細(xì)菌素含量最高，pH值過高或過低均會(huì)影響益生菌產(chǎn)細(xì)菌素的效果[11]。pH值4.0處理90 min時(shí)干酪乳桿菌ATCC393處于酸脅迫的亞適應(yīng)條件。細(xì)胞內(nèi)部的酸化會(huì)減弱對(duì)酸敏感的酶活性，對(duì)蛋白、DNA造成損傷。酸脅迫時(shí)，酸應(yīng)激誘導(dǎo)了許多伴侶蛋白和與脂肪酸合成的相關(guān)基因，抑制了關(guān)于類異戊二烯合成的甲羥戊酸途徑的基因，從而影響了細(xì)胞膜的流動(dòng)性[12]。Renhui Huang等對(duì)有酸和無酸處理植物乳桿菌zdy2013也證實(shí)了酸處理組顯著提高了飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸的比例，不同程度的調(diào)控了一些與質(zhì)子泵、氨基酸代謝、糖代謝、Ⅰ類和Ⅲ類應(yīng)激反應(yīng)途徑有關(guān)的基因。其中脂肪酸合成和堿生產(chǎn)中所涉及的基因表達(dá)明顯上調(diào)[13]。袁崢等也證實(shí)了這一點(diǎn)，隨著pH值的下降，嗜酸乳桿菌細(xì)胞膜質(zhì)子泵相關(guān)酶H+-ATPase活性升高，同時(shí)菌體由纖細(xì)型變得粗壯，細(xì)胞膜單不飽和脂肪酸變多、碳鏈變長(zhǎng)。精氨酸脫亞氨酸酶的酶活性增強(qiáng)，益生菌可能通過這些變化維持細(xì)胞正常的生理功能[14]。Wu C研究干酪乳桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸也參與了酸脅迫的耐受性，添加天冬氨酸提高了酸脅迫下干酪乳桿菌的生長(zhǎng)性能和存活率[15]。

1.4溫度脅迫益生菌在30℃～37℃細(xì)菌素產(chǎn)生最高，低溫時(shí)益生菌生理狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，為了適應(yīng)溫度脅迫，益生菌能夠誘導(dǎo)冷應(yīng)激蛋白的合成來維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，維持DNA螺旋及DNA合成效率。同樣熱脅迫也會(huì)對(duì)菌體存活造成不利影響，如使非共價(jià)鍵結(jié)合不牢，核糖體、RNA的不穩(wěn)定以及膜流動(dòng)性的改變。益生菌面對(duì)脅迫時(shí)，可產(chǎn)生熱應(yīng)激蛋白，大部分熱應(yīng)激蛋白屬于分子伴侶蛋白，能夠修復(fù)蛋白的生物學(xué)功能，增強(qiáng)益生菌對(duì)熱應(yīng)激的耐受能力[16]。

1.5饑餓脅迫益生菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏的狀態(tài)下，體內(nèi)的毒素-抗毒素系統(tǒng)會(huì)直接作用于DNA促旋酶和信使RNA，介導(dǎo)一種在不良生長(zhǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制基因表達(dá)，從而降低蛋白的合成速率，有利于自身節(jié)省能量和營(yíng)養(yǎng)，在營(yíng)養(yǎng)不良的環(huán)境中生存。

1.6氧脅迫非自由基類的氧衍生物統(tǒng)稱為活性氧族?；钚匝踝骞舻鞍踪|(zhì)、脂類和核酸等細(xì)胞物質(zhì)，是造成細(xì)胞衰老和死亡的主要原因之一。在一些乳桿菌發(fā)現(xiàn)了催化分子氧形成H2O2和利用脂肪酸的去飽和化反應(yīng)消耗分子氧清除分子氧[17]。Scott等在Lactococcus lactic氧脅迫中發(fā)現(xiàn)FlpA和FlpB蛋白能夠調(diào)控Zn（II）水平的升高，保護(hù)蛋白質(zhì)己被氧化的自由疏基基團(tuán)呈還原狀態(tài)，阻止二硫鍵的形成，從而避免易受活性氧族的攻擊[18]。左芳雷等研究發(fā)現(xiàn)，氧脅迫雙歧桿菌B.longum BBMN6時(shí)，B.longum BBMN6可以通過改變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)以適應(yīng)氧化脅迫，同時(shí)產(chǎn)生多磷酸鹽作為分子伴侶以保護(hù)蛋白質(zhì)。促進(jìn)活性氧的降解和維持氧化還原平衡、誘導(dǎo)一般脅迫反應(yīng)、參與DNA和蛋白質(zhì)修復(fù)、中心代謝途徑等生理過程的適應(yīng)性調(diào)整[19]。

1.7乙醇脅迫朱敏研究發(fā)現(xiàn)，乙醇脅迫后面包乳桿菌D2-5、植物乳桿菌D5-5、干酪乳桿菌D5-8存活率顯著降低，使關(guān)鍵酶丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶和ATP酶失活、使細(xì)胞膜通透性增加、完整性被破壞[20]。Garbay S發(fā)現(xiàn)在葡萄酒的培養(yǎng)基中，酒酒球菌通過脂肪酸含量降低、膜蛋白升高提高了存活率[21]。隨著生物演化，酒酒球菌不斷調(diào)整膜組分耐受了各種脅迫，能夠進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic Fementation，MLF），在增強(qiáng)抗逆性和供給能量方面發(fā)揮著重要作用，當(dāng)pH值較低時(shí)，MLF能夠通過保持細(xì)胞內(nèi)適合的pH值，維持酶的活性；MLF還可以通過物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，由pmf合成ATP，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。H+-ATP酶也參與了耦合ATP的水解，將質(zhì)子排出細(xì)胞，從而維持質(zhì)子推動(dòng)力和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，均在抗酸機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[22]。

2　益生菌適應(yīng)性基因

益生菌基因組的研究有助于揭示益生菌的遺傳和代謝機(jī)制，目前，微進(jìn)化遺傳變異的機(jī)制包括二種：大量數(shù)據(jù)顯示，益生菌能夠通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得一段遺傳物質(zhì)以適應(yīng)新環(huán)境[23]，在獲得新基因的同時(shí)，會(huì)將“無用”基因鈍化和消亡[24]；另一種是通過自身基因的變異。自2001年第一株乳酸菌全基因測(cè)序完成后，掀起了多個(gè)益生菌全基因測(cè)序的浪潮，許多研究者發(fā)現(xiàn)，改變某個(gè)基因后，會(huì)對(duì)益生菌的環(huán)境耐受性和益生菌特性發(fā)生改變。

2.1RR基因?qū)?nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離的L.fermentum MG進(jìn)行RR基因敲除后的突變體和L.fermentum MG野生型研究發(fā)現(xiàn)，突變體耐酸、耐膽鹽能力差，糞便中排出的L.fermentum MG活菌數(shù)量高，胃部和腸道部?jī)?nèi)容物和刮取物中的活菌數(shù)量低，對(duì)果糖和蔗糖的利用能力也顯著減弱。該試驗(yàn)結(jié)果提示，RR基因在L.fermentum MG野生型中對(duì)胃腸道粘附作用、滲透壓的改變、酸性環(huán)境等外環(huán)境的變化、碳水化合物的代謝具有負(fù)調(diào)控作用[25]。

2.2CCPA基因分解代謝調(diào)控蛋白A（catabolite controlprotein A，CCPA）是一種多效調(diào)節(jié)蛋白，在乳酸乳球菌和植物乳桿菌中的有氧代謝調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用[26]。它能夠調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和有氧代謝，間接或直接調(diào)控許多涉及能量和氮代謝基因的轉(zhuǎn)錄。Li等研究發(fā)現(xiàn)，敲除CCPA基因后，代謝產(chǎn)物、酶活性、壓力耐受性、抑菌效果降低[27]。

2.3recA基因Duwat等發(fā)現(xiàn)recA基因突變的Lactococcus lactis較野生型菌株對(duì)分子氧更敏感。研究人員推測(cè)recA基因編碼的蛋白可能是通過直接修復(fù)損傷的DNA，來達(dá)到對(duì)抗氧脅迫的目的，也可能是在分子氧造成的DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮間接的調(diào)控作用。試驗(yàn)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Lactococcus lactis突變株中分子伴侶蛋白的總水平降低[28]。

3　小結(jié)

益生菌在食品制造、加工和儲(chǔ)存過程中所遇到的壓力會(huì)降低它們的存活、穩(wěn)定性和功能性，從而對(duì)功能性食品的性能有負(fù)面影響。了解威脅條件下益生菌細(xì)胞蛋白、水解泵、關(guān)鍵酶等應(yīng)激改變以及益生菌環(huán)境適應(yīng)性基因有利于進(jìn)一步挖掘成熟菌株的應(yīng)用潛力，同時(shí)也為篩選具有高脅迫抗性的優(yōu)良菌株提供了可借鑒的思路。如何利用環(huán)境對(duì)益生菌的脅迫，仍需我們進(jìn)一步了解微生物的細(xì)胞機(jī)制、潛在的耐受性、微生物細(xì)胞機(jī)制的耐受性以及如何改善壓力阻力等。

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S816.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

0529-6005（2016）07-0121-03

2016-3-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372413）

潘娜（1991-），女，碩士生，主要從事動(dòng)物分子病原學(xué)研究，E-mail：751579895@qq.com

胡桂學(xué)，E-mail：guixue1964@126.com