飼用乳酸菌高密度培養(yǎng)的研究進(jìn)展

劉輝，季海峰，王四新，張董燕，王晶，單達(dá)聰，王雅民

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京海淀100097）

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綜述

飼用乳酸菌高密度培養(yǎng)的研究進(jìn)展

劉輝，季海峰*，王四新，張董燕，王晶，單達(dá)聰，王雅民

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京海淀100097）

高密度培養(yǎng)是提高微生物產(chǎn)量的有效途徑和手段。將高密度培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于飼用乳酸菌的生產(chǎn)，可以大大提高生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，并且加速乳酸菌制劑的商品化進(jìn)程，使其能夠更好地滿足市場(chǎng)需求。本文就乳酸菌高密度培養(yǎng)的主要影響因素及培養(yǎng)方式進(jìn)行了綜述，為飼用乳酸菌的高密度培養(yǎng)提供參考。

乳酸菌；高密度培養(yǎng)；影響因素；培養(yǎng)方式

乳酸菌具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境、增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)功能。乳酸菌的生產(chǎn)主要通過(guò)液體培養(yǎng)，但由于乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求比較苛刻，并且在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷消耗營(yíng)養(yǎng)底物和產(chǎn)生有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，抑制了菌體自身的生長(zhǎng)繁殖，采用常規(guī)方法培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液中的活菌數(shù)一般只能達(dá)到107～109cfu/mL，較低的生物量制約了乳酸菌的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

高密度培養(yǎng)（HDC）是提高微生物產(chǎn)量的有效途徑和手段。由于不同菌種（或菌株）所能達(dá)到的最高菌體濃度相差較大，目前對(duì)高密度培養(yǎng)沒(méi)有確切定義，一般是指在液體發(fā)酵培養(yǎng)中，采用一定的技術(shù)手段和設(shè)備將菌體密度提高到常規(guī)培養(yǎng)數(shù)倍以上的培養(yǎng)技術(shù)。相對(duì)于普通培養(yǎng)，高密度培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)在于可減少培養(yǎng)體積、縮短生產(chǎn)周期，獲得較高的目標(biāo)菌體密度，減少動(dòng)力消耗從而降低生產(chǎn)成本（Riesenberg和Guthke，1999）。乳酸菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)，不僅與所用的培養(yǎng)基有直接關(guān)系，也與培養(yǎng)方式密切相關(guān)，其核心技術(shù)是在保證一定營(yíng)養(yǎng)供給的同時(shí)解除代謝產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，即保持穩(wěn)定的比生長(zhǎng)速率、合理的營(yíng)養(yǎng)供給和代謝產(chǎn)物的去除（李寅等，2006）。

1　影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的因素

影響乳酸菌增殖的主要因素包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)溫度、pH值、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、代謝產(chǎn)物等。乳酸菌要通過(guò)高密度培養(yǎng)技術(shù)達(dá)到理想的高濃度產(chǎn)量，需要優(yōu)化一系列相關(guān)的工藝參數(shù)，消除或減少這些因素對(duì)培養(yǎng)的影響。

1.1營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜，正常生長(zhǎng)需要碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素、生長(zhǎng)因子及水等基礎(chǔ)物質(zhì)（Dumbrepatil等，2008）。培養(yǎng)基中各組分的濃度和比例要適當(dāng)，特別需要注意的是碳源和氮源的比例：碳氮比若偏小，菌體生長(zhǎng)旺盛會(huì)導(dǎo)致提前衰老自溶；若過(guò)大，則菌體繁殖數(shù)量低；碳氮比合適，但碳氮源濃度高，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵初期菌體大量繁殖而后期生長(zhǎng)緩慢，代謝廢物過(guò)多引起菌體的代謝異常；碳氮比合適，但濃度過(guò)低，也會(huì)影響菌體的繁殖數(shù)量。因此，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基各組分和比例進(jìn)行優(yōu)化篩選，使其能夠滿足乳酸菌的生長(zhǎng)需要，是實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度培養(yǎng)的前提。柏建玲等（2007）以改良MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選擇玉米漿、牛肉膏、乳糖、番茄汁、蛋白胨等7個(gè)營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化。結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等3種乳酸菌在優(yōu)化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到109cfu/mL以上，均高于原MRS培養(yǎng)基的細(xì)胞密度，并且發(fā)酵培養(yǎng)基的成本大大降低。高鵬飛等（2008）對(duì)Lactobacillus casei Zhang的增殖培養(yǎng)基優(yōu)化后，經(jīng)37℃、18 h培養(yǎng)，活菌數(shù)可達(dá)到4.78×109cfu/mL，比在MRS中的活菌數(shù)（4.8×108cfu/mL）提高近10倍。

1.2培養(yǎng)溫度溫度通過(guò)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及胞內(nèi)酶的活性來(lái)影響微生物的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，因此選擇適宜的發(fā)酵溫度對(duì)菌體的生長(zhǎng)繁殖意義重大。最適生長(zhǎng)溫度與菌株的種屬和來(lái)源、所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和菌體的生長(zhǎng)階段等有關(guān)，一般而言，乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～45℃。培養(yǎng)溫度還會(huì)影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。Gassem等（1997）認(rèn)為在接種溫度較低時(shí)活菌數(shù)量增加緩慢，有利于延長(zhǎng)乳酸菌的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，從而提高如胞外多糖等次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

1.3pH值pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝具有重要的影響。乳酸菌生長(zhǎng)的最適pH值一般為5.5～6.5，過(guò)高或過(guò)低都不利于菌體生長(zhǎng)，因此需要通過(guò)試驗(yàn)確定最適宜菌體快速生長(zhǎng)和繁殖的pH值。馮鎮(zhèn)和張?zhí)m威（2009）對(duì)嗜熱鏈球菌St-1進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中的pH穩(wěn)定在6.0時(shí)，其活菌數(shù)目以及發(fā)酵的活力最高。Beal等（1989）的研究則表明，保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的最佳生長(zhǎng)pH值為5.8，嗜熱鏈球菌為6.5。

1.4攪拌轉(zhuǎn)速乳酸菌在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)迅速利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生代謝物乳酸，并且由于菌體比重較大容易沉積到發(fā)酵液底部，因此在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)適當(dāng)攪拌，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和乳酸均勻分散，菌體能夠及時(shí)利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并排出代謝產(chǎn)物。由于攪拌造成的剪切力對(duì)菌體的分裂生長(zhǎng)不利，因此攪拌轉(zhuǎn)速不宜過(guò)大，應(yīng)通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳值。

1.5接種量適宜的接種量也是保證菌體高產(chǎn)的重要因素。一般來(lái)說(shuō)，接種量小，菌體遲緩期變長(zhǎng)，發(fā)酵周期也相應(yīng)延長(zhǎng)；接種量大，有利于種子液中水解酶對(duì)基質(zhì)的利用，可以縮短遲緩期，促進(jìn)乳酸菌快速生長(zhǎng)，但接種量過(guò)高會(huì)引起菌體過(guò)快生長(zhǎng)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用過(guò)快和代謝產(chǎn)物積累過(guò)多，反而不利于菌體后期生長(zhǎng)。熊曉輝等（2004）對(duì)一株乳酸菌進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種量為5%時(shí)的活菌數(shù)要高于接種量為3%和7%的活菌數(shù)。

1.6培養(yǎng)時(shí)間高密度培養(yǎng)的發(fā)酵終點(diǎn)判定十分重要，一般應(yīng)在菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期初期時(shí)及時(shí)停止發(fā)酵，防止生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期影響菌體活力。為此需要考察菌體的生長(zhǎng)曲線，通過(guò)檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間的活菌數(shù)，根據(jù)測(cè)得的活菌數(shù)最大值來(lái)確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.7代謝產(chǎn)物多數(shù)乳酸菌為同型乳酸發(fā)酵，其糖酵解途徑的最終產(chǎn)物是乳酸。乳酸可作為一種解偶聯(lián)劑使培養(yǎng)基中的質(zhì)子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低胞內(nèi)pH值，最終導(dǎo)致菌體停止生長(zhǎng)。如何消除發(fā)酵過(guò)程中乳酸積累對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的抑制是實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。目前，國(guó)外正在研究通過(guò)乳酸菌的代謝途徑進(jìn)行基因工程調(diào)控，以降低抑制產(chǎn)物的生成（Upadhyaya等，2014）。

2　乳酸菌高密度培養(yǎng)方式

乳酸菌高密度培養(yǎng)的主要方式有緩沖鹽法、化學(xué)中和法、細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)法、透析培養(yǎng)法、補(bǔ)料分批培養(yǎng)法和微囊化培養(yǎng)法等。

2.1緩沖鹽法培養(yǎng)基中乳酸不斷積累導(dǎo)致pH降低是抑制乳酸菌生長(zhǎng)的直接原因（Goncalves等，1997）。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加緩沖鹽，可調(diào)節(jié)和控制培養(yǎng)液的pH在一定范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，能在一定程度上緩解乳酸造成的低pH對(duì)菌體的抑制，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)繁殖（Schoug等，2008）。常用的緩沖鹽有磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和碳酸鈣等。劉云鶴和何煜波（2002）對(duì)3種緩沖鹽研究發(fā)現(xiàn)，添加一定量的緩沖鹽對(duì)發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌細(xì)胞的積累有顯著促進(jìn)作用，其中以磷酸氫二鉀的促進(jìn)作用最為明顯，檸檬酸三銨次之，乙酸鈉最弱。馮友軍等（2003）將10%檸檬酸鈉、5%乙酸鈉和2%丙酮酸鈉按一定比例配成復(fù)合緩沖體系，能使乳酸菌的發(fā)酵終濃度從2.22×108cfu/mL提高到1.32×109cfu/mL。由于緩沖鹽的緩沖作用有一定的范圍，發(fā)酵菌液不能達(dá)到很高的菌體濃度，而且高鹽濃度也會(huì)對(duì)乳酸菌菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。

2.2化學(xué)中和法通過(guò)流加中和劑，將乳酸菌發(fā)酵過(guò)程當(dāng)中產(chǎn)生的過(guò)量乳酸中和，維持發(fā)酵液的pH保持在菌體生長(zhǎng)的最適pH范圍內(nèi)，可以促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)。常用的中和劑有氨水、氫氧化鈉、氫氧化鈣和碳酸鈉等。不同的中和試劑對(duì)不同菌株的作用不同。Krzywonos和Eberhard（2011）認(rèn)為氨水比氫氧化鈉溶液更適用于植物乳桿菌的發(fā)酵。而王艷萍等（2009）認(rèn)為檸檬酸鈉比氨水更適合嗜酸乳桿菌6012的生長(zhǎng)繁殖?；瘜W(xué)中和法可獲得高密度的菌體，并且簡(jiǎn)便易行，是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法，但當(dāng)乳酸與滴加的堿液反應(yīng)產(chǎn)生乳酸氨或乳酸鈉等鹽類(lèi)物質(zhì)的濃度到達(dá)一定的濃度時(shí)，也會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)繁殖，其最高密度也只能達(dá)到109～1010cfu/mL（Mufandaedza等，2006）。

2.3細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)法細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)法是指在連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中采用沉積、離心、膜過(guò)濾（超濾、微濾膜等）等方法將流出發(fā)酵液中的菌體截留并返回到發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)向發(fā)酵罐中補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基保持發(fā)酵液體積恒定的培養(yǎng)方式。這種方式結(jié)合了連續(xù)培養(yǎng)和超濾的優(yōu)點(diǎn)，既可以用低濃度的培養(yǎng)基得到較高的細(xì)胞密度，除去培養(yǎng)基中的抑制性代謝產(chǎn)物，又可以就地分離產(chǎn)物，強(qiáng)化下游操作。劉振民（2004）采用超濾膜對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種培養(yǎng)液進(jìn)行了濃縮。結(jié)果表明，兩種菌的菌體均可被超濾膜有效截留，濃縮后的菌體密度可達(dá)9.79×109cfu/mL。Hayakawa等（1990）采用耐熱的無(wú)機(jī)膜錯(cuò)流過(guò)濾方法對(duì)干酪乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，活菌數(shù)可達(dá)1011cfu/mL。細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)存在的問(wèn)題是膜容易污染，不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)操作，如何選擇合適的膜組件和克服膜污染的問(wèn)題是研究的重點(diǎn)。

2.4透析培養(yǎng)法在發(fā)酵過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累是導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)停止的主要原因。培養(yǎng)時(shí)利用透析膜包裹微生物，并使外部有新鮮培養(yǎng)液流動(dòng)的培養(yǎng)方法稱(chēng)為透析培養(yǎng)法。透析培養(yǎng)可以有效去除培養(yǎng)液中有害的低分子量代謝產(chǎn)物，同時(shí)向培養(yǎng)液提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供菌體利用。與細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)法相比，透析培養(yǎng)中的透析膜不會(huì)被阻塞，可以長(zhǎng)時(shí)間維持其滲透性能。這種培養(yǎng)方式可以省去耗時(shí)的培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程，大大提高了生物量的積累。Osborne（1977）將透析培養(yǎng)法用于乳酸桿菌培養(yǎng)，獲得了1×1011cfu/mL的高菌體密度。但是，由于透析培養(yǎng)設(shè)備需要內(nèi)嵌的透析膜或外在的透析組件、輔助泵及發(fā)酵罐等，設(shè)備投資較大，對(duì)操作技術(shù)要求較高，限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2.5補(bǔ)料分批培養(yǎng)法補(bǔ)料分批培養(yǎng)法（又稱(chēng)流加培養(yǎng)法）是根據(jù)菌株生長(zhǎng)和初始培養(yǎng)基的特點(diǎn)，在分批培養(yǎng)的某些階段以某種方式間歇地或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體及其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間延長(zhǎng)的培養(yǎng)方式。其最大特點(diǎn)是能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，不僅避免了過(guò)高的初始營(yíng)養(yǎng)成分濃度產(chǎn)生的抑制，而且可以防止?fàn)I養(yǎng)成分被耗盡后產(chǎn)生的限制作用。與透析培養(yǎng)和細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)相比，補(bǔ)料分批培養(yǎng)不需要增添設(shè)備，只需對(duì)工藝進(jìn)行改進(jìn)，并且操作簡(jiǎn)單、靈活，能夠避免分批操作的許多缺點(diǎn)，現(xiàn)已成為細(xì)菌高密度培養(yǎng)中最有競(jìng)爭(zhēng)力的方式之一。補(bǔ)料分批培養(yǎng)的關(guān)鍵問(wèn)題是選擇合適的補(bǔ)料流加策略。目前主要有兩種策略控制流加營(yíng)養(yǎng)物：反饋補(bǔ)料和非反饋補(bǔ)料。反饋補(bǔ)料包括pH-stat法、DO-stat法、菌體濃度反饋法、呼吸商法等；非反饋補(bǔ)料可分為恒速補(bǔ)料、變速補(bǔ)料、間歇補(bǔ)料和指數(shù)補(bǔ)料等。反饋補(bǔ)料中，pH-stat法和DO-stat法相對(duì)簡(jiǎn)單和便宜，因而較為常用。非反饋補(bǔ)料中，指數(shù)補(bǔ)料可以將反應(yīng)器中基質(zhì)的初始濃度控制在較低的水平，有效減少有害代謝物的積累，并使菌體密度以一定的比生長(zhǎng)速率呈指數(shù)形式增加。劉振民等（2008）對(duì)保加利亞乳桿菌的補(bǔ)料分批培養(yǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：控制pH 6.0進(jìn)行培養(yǎng)，在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期進(jìn)行全營(yíng)養(yǎng)物料的連續(xù)補(bǔ)料，最終的菌體密度提高2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，活菌數(shù)可達(dá)1.0× 1011cfu/mL。Xiong等（2012）比較了恒速補(bǔ)料、指數(shù)補(bǔ)料和分批培養(yǎng)對(duì)植物乳桿菌NCU116生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)采用指數(shù)補(bǔ)料策略可以使菌體濃度達(dá)到9.35×109cfu/mL，遠(yuǎn)高于其他兩種培養(yǎng)模式。

2.6微囊化培養(yǎng)法微囊化培養(yǎng)法是固定化技術(shù)的一種，是用一層親水性的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊內(nèi)，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)后囊內(nèi)細(xì)胞可以達(dá)到很高的密度。乳酸菌微囊化避免了傳統(tǒng)懸浮發(fā)酵劑的缺點(diǎn)和限制，從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞不需經(jīng)過(guò)超濾或冷凍離心，使用普通的離心或過(guò)濾就可進(jìn)行，因此大大降低了生產(chǎn)成本。另外，微囊化技術(shù)可以防止氧對(duì)雙歧桿菌等厭氧菌的傷害，在冷凍過(guò)程中有很好的保護(hù)作用。閆穎娟等（2014）采用微囊化技術(shù)將保加利亞乳桿菌FMG-4包裹在球狀的液芯微囊內(nèi)，采用連續(xù)培養(yǎng)的方法進(jìn)行高密度培養(yǎng)，菌體密度達(dá)到3.18×1011cfu/g。Doleyres等（2002）利用結(jié)凝膠固定化進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌培養(yǎng)，其菌體密度是細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的9.5倍。

3　結(jié)語(yǔ)

乳酸菌的高密度培養(yǎng)已成為當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一，也是實(shí)現(xiàn)乳酸菌規(guī)模化生產(chǎn)的重要目標(biāo)和方向。乳酸菌的高密度培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于乳制品行業(yè)，而在飼料行業(yè)中的研究和應(yīng)用才剛剛起步，仍有諸多技術(shù)難題尚待解決，如適合的飼用乳酸菌菌種相對(duì)較少、菌體代謝理論不完善、對(duì)發(fā)酵設(shè)備和發(fā)酵條件的要求高、工藝調(diào)控過(guò)程復(fù)雜、對(duì)生產(chǎn)成本控制要求較高等。隨著高密度培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于飼用乳酸菌的生產(chǎn)，將大大提高乳酸菌的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，加速飼用乳酸菌制劑的商品化進(jìn)程，從而更好地滿足市場(chǎng)需求和提高產(chǎn)品在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。

［1］柏建玲，莫樹(shù)平，鄭婉玲，等.乳酸菌增菌培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)因子優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（2）：79～81.

［2］馮友軍，王靜，張淑娟，等.保加利亞乳桿菌增菌條件的初步研究［J］.廣西輕工業(yè)，2003，3：10～13.

［3］馮鎮(zhèn)，張?zhí)m威.不同pH值培養(yǎng)乳酸球菌對(duì)其發(fā)酵活力的影響［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37（3）：16～18.

［4］高鵬飛，李妍，趙文靜，等.益生菌Lactobocillus casei Zhang增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（4）：623～628.

［5］李寅，高海軍，陳堅(jiān).高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.3～12.

［6］劉云鶴，何煜波.肉品發(fā)酵劑增殖培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，28（3）：234～236.

［7］劉振民，蔣士龍，莫蓓紅.德氏乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料分批培養(yǎng)研究［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2008，6：263～265.

［8］劉振民.采用微濾膜濃縮乳酸菌發(fā)酵液的工藝條件研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（10）：73～76.

［9］王艷萍，習(xí)傲登，許女，等.嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)及發(fā)酵劑的研究［J］.中國(guó)釀造，2009，5：111～116.

［10］熊曉輝，于修鑑，熊強(qiáng)，等.乳酸菌發(fā)酵劑高密度培養(yǎng)的研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2004，5：17～21.

［11］閆穎娟，盧儉，周劍忠，等.基于響應(yīng)曲面法的微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2014，35（17）：153～159.

［12］Beal C，Louvet P，Corrieu G.Influence of controlled pH and temperature on the growth and acidification of pure cultures of Strptococcns thermophilus 404 and Lactobacillus bulgaricus 398［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1989，32： 148～154.

［13］Doleyres Y，Paquin C，Leroy M，et al.Bifidobacterium longum ATCC 15707 cell production during free-and immobilized-cell cultures in MRS-whey permeate medium［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60（1-2）：168～173.

［14］Dumbrepatil A，Adsul M，Chaudhari S，et al.Utilization of molasses sugar for lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii mutant Uc-3 in batch fermentation［J］.Appl Environ Microb，2008，74（1）：333～335.

［15］Gassem M A，Schmidt K A，F(xiàn)rank J F.Exopolysaccharide production from whey lactose by fermentation with Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus［J］.J Food Sci，1997，62（1）：171～173.

［16］Goncalves L M D，Ramos A，Almeida J S，et al.Elucidation of the mechanism of lactic acid growth inhibition and production in batch cultures of Lactobacillus rhamnosus［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1997，48：346～350.

［17］Hayakawa K，Sansawa H，Nagamume T，et al.High density culture of Lactobacillus casei by a cross-flow culture method based on kinetic properties of the microorganism［J］.J Ferment Bioeng，1990，70（6）：404～408.

［18］Krzywonos M，Eberhard T.High density process to cultivate Lactobacillus plantarum biomass using wheat stillage and sugar beet molasses［J］.Electron J Biotechn，2011，14（2）：12～18.

［19］Mufandaedza J，Viljoen B C，F(xiàn)eresu S B，et al.Antimicrobial properties of lactic acid bacteria and yeast-LAB cultures isolated from traditional fermented milk against pathogenic Escherichia coli and Salmonella enteritidis strains［J］.Int J Food Microbiol，2006，108（1）：147～152.

［20］Osborne R J W.Production of frozen concentrated cheese starters by diffusion culture［J］.J Soc Dairy Technol，1977，30（1）：40～44.

［21］Riesenberg D，Guthke R.High cell density cultivation of microorganisms［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1999，51：422～430.

［22］Schoug A，F(xiàn)ischer J，Heipieper H J，et al.Impact of fermentation pH and temperature on freeze-drying survival and membrane lipid composition of Lactobacillus coryniformis Si3［J］.J Ind Microbiol Biot，2008，35（3）：175～181.

［23］Upadhyaya B P，DeVeaux L C，Christopher L P.Metabolic engineering as a tool for enhanced lactic acid production［J］.Trends Biotechnol，2014，32（12）：637～644.

［24］Xiong H L，Chen J L，Wang H，et al.Influences of volatile solid concentration，temperature and solid retention time for the hydrolysis of waste activated sludge to recover volatile fatty acids［J］.Bioresource Technol，2012，119：285～292.

High density culture is an effective way and means to improve the production of microorganism.The high density culture technology used in the production of Lactic acid bacteria preparation would increase the product efficiency，reduce the cost of production，and accelerate the commercialization process of Lactic acid bacteria preparation to meet the market demand.This paper reviewed the main influencing factors and culture methods of high density culture，which would offer the

for the high density culture of Lactic acid bacteria preparation in feed.

Lactic acid bacteria；high density culture；influencing factors；culture methods

S816.7

A

1004-3314（2016）04-0011-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160403

北京市科技計(jì)劃（Z141100002614002）；生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（GWZJ-2009-06）；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（QNJJ201408）