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    γ-氨基丁酸產(chǎn)生菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化

    2016-10-26 09:34:13汪祥燕徐海燕辛國(guó)芹汪孟娟董佩佩趙影谷巍
    中國(guó)飼料 2016年4期
    關(guān)鍵詞:氨基丁酸氮源菌體

    汪祥燕,徐海燕,辛國(guó)芹,汪孟娟,董佩佩,趙影,谷巍

    (山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司,山東泰安271000)

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    添加劑

    γ-氨基丁酸產(chǎn)生菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化

    汪祥燕*,徐海燕,辛國(guó)芹,汪孟娟,董佩佩,趙影,谷巍

    (山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司,山東泰安271000)

    γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有許多重要的生理功能。利用酸菜、酸奶等食品進(jìn)行乳酸菌的分離,通過(guò)紙層析法篩選得到1株產(chǎn)GABA量較高的菌株Y-3,經(jīng)16SrDNA鑒定該菌株為短乳桿菌。單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定的菌株Y-3最佳發(fā)酵條件為:葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸鈉1.0%、丁二酸鈉0.5%,初始pH為6.0,接種量6%,37℃靜置培養(yǎng)48 h,GABA產(chǎn)量達(dá)12 g/L以上,比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了近5倍。

    γ-氨基丁酸;分離;短乳桿菌;發(fā)酵

    γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然存在的非蛋白氨基酸,屬?gòu)?qiáng)神經(jīng)抑制性氨基酸,具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、降血壓的作用(Li等,2010)。應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中能有效地提高動(dòng)物抗應(yīng)激能力和抗缺氧能力,改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)(譚良溪等,2012;吳俊鋒和李呂木,2011)。通過(guò)減少動(dòng)物的無(wú)意識(shí)運(yùn)動(dòng)以減少能量消耗,達(dá)到促生長(zhǎng)的目的(吳凡和譚青松,2015;徐秋良等,2009)。GABA廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物中,合成制備方法主要有化學(xué)合成、植物富集和微生物發(fā)酵3種(Dhakal等,2012)。目前GABA的生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法,而安全性高的乳酸菌可以利用體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶,將L-谷氨酸鈉經(jīng)α-脫羧后產(chǎn)生GABA,開發(fā)前景廣闊。陸小雪等(2009)從泡菜和酸奶中分離出3株產(chǎn)GABA的乳酸菌,分別為乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種,其發(fā)酵液中GABA含量分別達(dá)到3.680、3.341、2.700 g/L。蔣冬花等(2007)分離出相對(duì)高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌,在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵液中GABA含量可達(dá)4 g/L。本試驗(yàn)從泡菜、酸奶等食品中分離高產(chǎn)GABA菌株,對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,并優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件,為微生物發(fā)酵富集GABA的研究及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料泡菜、酸菜及各品牌的酸奶(伊利、蒙牛、亞奧特)等。

    1.2培養(yǎng)基

    1.2.1分離培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、吐溫-80 1 g/L、K2HPO42 g/L、醋酸鈉5 g/L、檸檬酸二胺2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、pH 6.5~6.8,37℃培養(yǎng)48 h。

    1.2.2種子培養(yǎng)基K2HPO42 g/L,檸檬酸三銨2 g/L,無(wú)水乙酸鈉5 g/L,MnSO4·H2O 0.25 g/L,MgSO4·7H2O 0.58 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母膏5 g/L。

    1.2.3TYG發(fā)酵培養(yǎng)基胰蛋白胨5 g/L,酵母膏5 g/L,葡萄糖10 g/L,丁二酸鈉5 g/L,L-谷氨酸鈉10 g/L,pH 6.6~6.8。

    1.3試驗(yàn)方法

    1.3.1乳酸菌的分離分別取泡菜汁、酸菜汁及伊利、蒙牛、亞奧特酸奶各1 mL,接種于50 mL分離培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3 d,取富集培養(yǎng)液各1 mL,分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度,將所有樣品稀釋液各取0.3 mL,倒入已滅菌的平皿中,然后倒入冷卻至50℃左右的分離培養(yǎng)基混勻,凝固后置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,挑取帶有溶鈣圈的菌落,接種于MRS斜面培養(yǎng)基。

    1.3.2乳酸菌的篩選將初篩得到的菌株轉(zhuǎn)接于液體MRS種子培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)12~15 h,然后以2%的接種量接入到含1%L-谷氨酸鈉的TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液離心后進(jìn)行檢測(cè)分析。

    1.3.3分析方法

    1.3.3.1γ-氨基丁酸含量的測(cè)定GABA含量的測(cè)定采用紙層析-比色法。(1)展開:采用新華3號(hào)濾紙,每個(gè)樣品點(diǎn)樣4 μL,在室溫下用不飽和法展開,展開劑用(苯酚∶水=4∶1)上行法展開;(2)定量:配制0.5%的GABA標(biāo)準(zhǔn)品,點(diǎn)樣4 μL;菌株發(fā)酵液經(jīng)離心后,取上清液點(diǎn)樣4 μL,放入層析缸中展開;(3)顯色:展開結(jié)束后自然晾干,用0.5%的茚三酮無(wú)水乙醇溶液噴淋,在65℃顯色30 min;(4)比色測(cè)定:剪下GABA顯色條帶,用5 mL硫酸銅乙醇溶液(0.1%硫酸銅溶液∶75%乙醇=2∶38)浸泡30 min,然后測(cè)定520 nm波長(zhǎng)下的吸光值(A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A值和樣品的A值即可計(jì)算出樣品的GABA含量。

    1.3.3.2菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中,在一定時(shí)間取培養(yǎng)液,以空白培養(yǎng)基作對(duì)照,于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD600)。

    1.3.3.3pH的測(cè)定采用PHS-3C型精密pH計(jì)測(cè)定。

    1.3.4發(fā)酵條件優(yōu)化采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。

    1.3.5菌株的鑒定

    1.3.5.116SrDNA擴(kuò)增與序列分析目的菌株接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,采用天根公司的試劑盒提取菌體DNA,并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。所用引物為通用引物:1492r 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'27f 5'-AGAGTTG ATCCTGGCTCAG-3';PCR反應(yīng)體系(50 μL)為:Mixture 25 μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等,天根生化科技有限公司),上下游引物各1 μL,模板DNA 2 μL,超純水21 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min,94℃變性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

    1.3.5.2系統(tǒng)發(fā)育分析登錄GenBank(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov),利用Blast對(duì)菌株16SrDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行檢索,并下載相關(guān)屬種的16SrDNA序列,采用DNAMAN、DNAclub、MEGA5.2等軟件進(jìn)行同源性分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1菌株篩選樣品經(jīng)處理后,利用乳酸菌選擇培養(yǎng)基從各分離源中共分離純化出113株乳酸菌,并編號(hào)保存。采用紙層析-比色法初篩,得到8株能夠利用L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化生成γ-氨基丁酸的菌株。

    由表1可知,不同菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力有一定差別,僅2株菌的GABA產(chǎn)量高于1 g/L,其中Y-3在未經(jīng)培養(yǎng)優(yōu)化的條件下,可產(chǎn)生GABA 2.21 g/L。將Y-3菌株傳接10代,分別測(cè)定Y-3菌株1~10代發(fā)酵后GABA產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)其GABA產(chǎn)量穩(wěn)定,為(2.36±0.22)g/L,后續(xù)對(duì)菌株Y-3進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

    表1 菌株篩選結(jié)果

    2.2菌株Y-3發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2.2.1接種量對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響由圖1看出,接種量對(duì)Y-3菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA有較大的影響。接種量為2%~4%時(shí),GABA產(chǎn)量在2.20 g/L左右;接種量增大至6%后,GABA產(chǎn)量明顯提高,達(dá)4.46 g/L,提高2倍;接種量大于6%后,GABA產(chǎn)量降低,反而不利于菌株生產(chǎn)GA-BA。所以,菌株Y-3最優(yōu)接種量確定為6%。

    圖1 接種量對(duì)Y-3菌株GABA產(chǎn)量的影響

    2.2.2pH對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0和自然pH(6.70左右),研究發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)、pH及GABA產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖2。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH增大,Y-3菌株的菌體量和發(fā)酵液pH逐漸增大。發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為4.0時(shí),發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體密度僅有1.084;而在起始pH為6.0時(shí),發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體密度為2.109,兩者相比,菌體密度增大了1倍。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH升高,GABA產(chǎn)量為先升高后降低,在pH=6.0時(shí)達(dá)最大,為3.10 g/L。在pH=6.0時(shí)菌體密度也較大,菌體量大代表有更多菌體參與GABA生產(chǎn),因而GABA產(chǎn)量才會(huì)提高。雖然自然pH時(shí)(6.70左右)菌體生長(zhǎng)量大于pH為6.0時(shí),但是此時(shí)的發(fā)酵液pH較低,降低了谷氨酸脫羧酶的活性,GABA產(chǎn)量反而沒有pH=6.0時(shí)高。綜合分析,發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH確定為6.0。

    圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)、pH及GABA產(chǎn)量的影響

    2.2.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響發(fā)酵時(shí)間對(duì)于菌株Y-3和PS-9生產(chǎn)GABA有很大的影響,結(jié)果見圖3。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),菌株Y-3的菌體密度逐漸增大,24 h達(dá)到最大,為2.109,之后處于基本穩(wěn)定狀態(tài)。發(fā)酵液pH在 24 h時(shí)最低,僅為2.94,然后升高,之后處于基本穩(wěn)定。分析原因可能是:24 h前菌株增殖速度快,處于菌體積累階段,菌株會(huì)迅速消耗葡萄糖,將其分解為小分子酸,使得發(fā)酵液pH降低,之后菌株Y-3會(huì)利用H+,在谷氨酸脫羧酶作用下將L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為GABA,又提高了發(fā)酵液的pH。且在一定范圍內(nèi),GABA產(chǎn)量是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大的,在48 h時(shí)達(dá)到最大,為3.57 g/L。此后,GABA產(chǎn)量有下降但不明顯。從培養(yǎng)周期和成本等工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)因素考慮,培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),確定菌株Y-3最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

    圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)、pH及GABA產(chǎn)量的影響

    2.3菌株Y-3發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

    2.3.1碳源對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉及丁二酸鈉為唯一碳源,添加量為10 g/L,發(fā)酵培養(yǎng)48 h后檢測(cè)發(fā)酵液的GABA含量,結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示,對(duì)于菌株Y-3,葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源最為適合,麥芽糖、可溶性淀粉和丁二酸鈉次之,蔗糖最差。葡萄糖作為可快速利用的碳源為菌株Y-3的生長(zhǎng)和GABA生產(chǎn)提供能量來(lái)源,故以其作碳源,無(wú)論是菌株生長(zhǎng),還是GABA產(chǎn)量都優(yōu)于其他碳源。

    圖4 碳源對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)和GABA產(chǎn)量的影響

    2.3.2氮源對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別選取胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨及硝酸鈉為唯一氮源,添加量為10 g/L,發(fā)酵培養(yǎng)48 h檢測(cè)發(fā)酵液的GABA含量。由圖5可知,對(duì)于菌株Y-3,有機(jī)氮效果比無(wú)機(jī)氮效果好。硫酸銨、硝酸鈉兩種無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵效果最差,紙層析圖上基本看不出條帶。酵母膏作為單一氮源發(fā)酵效果最好,GABA最高為5.95 g/L,其次是牛肉膏、蛋白胨和胰蛋白胨,玉米漿的效果較差。酵母膏中含有多種成分,相對(duì)于其他氮源,酵母膏的營(yíng)養(yǎng)成分可能更有利于乳酸菌的生長(zhǎng),且其可能含有刺激谷氨酸脫羧酶活性的因子,因此GABA產(chǎn)量較高。

    圖5 氮源對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)和GABA產(chǎn)量的影響

    進(jìn)一步,以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在以酵母膏作氮源的基礎(chǔ)上分別復(fù)合蛋白胨、牛肉膏和胰蛋白胨為復(fù)合氮源,發(fā)酵培養(yǎng)48 h,以紙層析-比色法測(cè)定上清中GABA含量。由圖6可知,對(duì)于菌株Y-3,以酵母膏和胰蛋白胨復(fù)合時(shí)發(fā)酵效果最好,GABA的產(chǎn)量達(dá)6.26 g/L,比酵母膏作唯一氮源時(shí)產(chǎn)量提高5%。所以,菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA試驗(yàn)選擇酵母膏復(fù)合胰蛋白胨作氮源。

    圖6 復(fù)合氮源對(duì)Y-3菌株生長(zhǎng)和GABA產(chǎn)量的影響

    2.3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源,酵母膏和胰蛋白胨為復(fù)合氮源,添加L-谷氨酸鈉,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2。

    表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

    由表2可知,葡萄糖添加量對(duì)于GABA的產(chǎn)量影響最大。各成分對(duì)GABA產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋浩咸烟牵疽鹊鞍纂耍窘湍父啵綥-谷氨酸鈉,極差分析的最優(yōu)組合為A3B2C3D1。試驗(yàn)中最優(yōu)組合為A3B1C3D2,GABA產(chǎn)量為12.67 g/L。由于最佳的培養(yǎng)基組成在試驗(yàn)中沒有進(jìn)行,所以根據(jù)正交試驗(yàn)給出的最佳培養(yǎng)基成分進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)量與7號(hào)試驗(yàn)相比沒有明顯提高??紤]成本等因素,確定菌株Y-3發(fā)酵配方為:葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸鈉1.0%、丁二酸鈉0.5%,pH 6.0。

    2.4發(fā)酵液處理及凍干粉γ-氨基丁酸含量測(cè)定按照優(yōu)化結(jié)果發(fā)酵培養(yǎng)菌株Y-3,在發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液凍干處理,計(jì)算100 mL發(fā)酵液的凍干粉比例,并以紙層析-比色法測(cè)定凍干粉中GABA的含量。結(jié)果顯示,100 mL發(fā)酵液凍干后可得到3.72 g凍干粉,凍干粉中GABA含量為4.6%左右。

    2.5菌株Y-3的鑒定

    2.5.1菌落及菌體形態(tài)該菌株在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h,其菌落形態(tài)扁平,白色不透明,邊緣光滑,表面濕潤(rùn),顯微鏡下觀察菌體為短桿狀,大多成對(duì)出現(xiàn),革蘭氏染色陽(yáng)性。

    2.5.216SrDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析該菌株的PCR產(chǎn)物電泳圖見圖7,條帶在1000~2000 bp處,約為1500 bp,與預(yù)期結(jié)果一致。

    圖7 菌株Y-3擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

    將菌株Y-3的16SrDNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,結(jié)果顯示菌株Y-3與Lactobacillus brevis的序列同源性達(dá)到100%。鑒定該菌株屬于短乳桿菌(Lactobacillus brevis)。

    從Genebank中調(diào)取并下載與菌株Y-3同源性較高的該屬內(nèi)其他相關(guān)菌株的16S rDNA,利用MEGA5.2軟件的Neighboring-joining方法,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8)。

    圖8 菌株Y-3與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

    3 小結(jié)

    從泡菜、酸菜及不同品牌酸奶等分離源中分離純化得到113株乳酸菌,并以TYG培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵,篩選到8株能產(chǎn)GABA的菌株。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,確定菌株Y-3最佳培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件為:葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸鈉1.0%、丁二酸鈉0.5%,初始pH為6.0,接種量6%,37℃靜置培養(yǎng)48 h,此時(shí)發(fā)酵液中GABA含量達(dá)12 g/L以上,比優(yōu)化前產(chǎn)量增加了近5倍。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行凍干處理,Y-3菌株100 mL發(fā)酵液凍干后可得4 g左右凍干粉,凍干粉中GABA含量為4.6%左右。通過(guò)16S rDNA鑒定,菌株Y-3為一株短乳桿菌。

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    γ-amino butyric acid(GABA)as a putative inhibitory in the vertebrate nervous system,has many important physiological functions.Using filter paper chromatography method,a lacto-bacteria Y-3 highly yielding GABA was isolated from different foods such as pickled vegetable and yoghourt.Y-3 was identified as Lactobacillus brevis by its cultural characteristics,morphological characteristics and 16S rDNA sequence.The optimal fermentation medium composition by single factor and orthogonal test showed as follows:glucose 1.5%,yeast extract 0.5%,tryptone 1.5%,L-sodium glutamate 1.0%,sodium succinate 0.5%.The better fermentation conditions were as follows:initial pH 6.0,inoculation amount 6%,temperature 37℃,fermentation 48 h.Using this optimization conditions,the GABA yield was over 12 g/L,which increased nearly 5 times than that before optimization.

    γ-amino butyric acid;isolation;Lactobacillus brevis;fermentation

    S816.7

    A

    1004-3314(2016)04-0027-05

    10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160407

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