偽狂犬病毒表達(dá)載體的研究進(jìn)展

趙 軍，黃劍波，朱 玲,2*，徐志文,2(.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物生物技術(shù)中心，四川 成都 630；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 630）

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偽狂犬病毒表達(dá)載體的研究進(jìn)展

趙 軍1，黃劍波1，朱 玲1,2*，徐志文1,2
(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130）

摘 要：隨著生物工程技術(shù)的逐步發(fā)展和完善，利用偽狂犬病毒作為載體的相關(guān)研究也取得了一定突破，為后續(xù)的偽狂犬基因工程疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。文中以缺失處理相關(guān)基因的偽狂犬病毒作為載體，與構(gòu)建的攜帶外源基因的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)同源重組的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：偽狂犬病毒；表達(dá)載體；研究進(jìn)展

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多種以動物發(fā)熱、奇癢及中樞神經(jīng)障礙為主要癥狀的一種急性傳染病。豬是PRV的主要宿主，成年豬一般為隱性感染，但終身帶毒和排毒，可致妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)木乃伊胎。該病最早于1813年在美國牛群中發(fā)現(xiàn)，由于臨床表現(xiàn)與狂犬病類似，故稱偽狂犬病。1902年Aujeszky證明該病病原為病毒，因而該病亦被稱為奧耶斯基病。因其具有流行快，傳播途徑多，病死率高的特點，現(xiàn)在已成為對全球養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一。每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織列為二類動物傳染病[1]。目前在生產(chǎn)養(yǎng)殖上常使用偽狂犬常規(guī)疫苗來預(yù)防本病發(fā)生，但常規(guī)疫苗在免疫時常出現(xiàn)毒力返強、散毒、免疫效率較低、過敏反應(yīng)、用量較大等弊端。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于偽狂犬病病毒的分子生物學(xué)研究取得了很大進(jìn)展，若將外源基因插入到偽狂犬病病毒基因組中構(gòu)建出重組病毒，不僅保持了原病毒良好的抗原性，且其毒力不返強，易與野毒區(qū)別。利用偽狂犬病病毒作為載體同目的基因一起在動物體內(nèi)表達(dá)，既安全又可達(dá)到一針多防的效果，對多種動物疫病的防控具有重大意義。

1　?PRV基因組的結(jié)構(gòu)

豬偽狂犬病毒(PRV)屬于皰疹病毒科α-病毒亞科的豬皰疹病毒I型。病毒基因組為線狀雙鏈DNA，長度約為150 kb，C+G含量約為74 %，由長獨特區(qū)(UL)和短獨特區(qū)(US)，以及US兩側(cè)的重復(fù)序列(TRS)與內(nèi)部重復(fù)序列(IRS)所組成。US和UL區(qū)段，含有至少70個基因，可編碼70-100種蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子只含有約50種蛋白質(zhì)[2]。其中在US區(qū)段的gD、gE、gG、gI、蛋白激酶基因、1lK 和28K 8種蛋白基因已被鑒定[3]；在UL區(qū)段有58種基因已經(jīng)被鑒定，包括gB(gⅡ)、gC(gⅢ)、gH、gK、gL、gM、gN、堿性核酸酶(AN)、核糖核苷還原酶(RR)、DNA多聚酶(POL)、136 ku DNA結(jié)合蛋白質(zhì)(DBP)、主要衣殼蛋白(MCP)和早期蛋白0(EP0)等基因。這些基因可編碼結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、毒力蛋白、酶類以及與病毒DNA復(fù)制、病毒釋放有關(guān)的蛋白[4]。在這些已經(jīng)鑒定的偽狂犬病病毒基因中，病毒在細(xì)胞中增殖的非必需基因超過一半。另外，還有些已知的毒力基因，如gD、gE、TK等缺失突變之后能顯著降低PRV的毒力，這部分DNA序列或基因可以通過缺失處理并被外源DNA置換，而仍使病毒正常生長，成為PRV作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)。

2　?偽狂犬病毒載體的優(yōu)勢

2.1安全性好

PRV不感染人，現(xiàn)有的活疫苗株Banha-K61或“783”等已在世界范圍內(nèi)應(yīng)用了幾十年，安全有效，一些國家還通過其消滅和根除了偽狂犬病。因此以PRV疫苗株為載體，在其基因組非必需區(qū)上插入外源基因獲得的重組病毒在安全性上值得肯定。

2.2外源基因容量大

目前在PRV長達(dá)143Kb的基因組中，大約有一半基因被認(rèn)為是非必需的。其中有些基因與病毒毒力有關(guān)，如gI、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等。這些基因的缺失或失活會不同程度地降低病毒的毒力，便于在多個非生長必需區(qū)內(nèi)先后或同時插入和表達(dá)數(shù)種外源基因而不顯著影響其生長繁殖，重組出具有各種應(yīng)用途徑的載體。

2.3生產(chǎn)工藝簡單，原材料來源方便

PRV疫苗以接種無特定病原體(SPF)雞胚成纖維細(xì)胞生產(chǎn)，目前包括我國在內(nèi)的大部分疫苗生產(chǎn)國都已掌握了SPF雞繁殖與生產(chǎn)技術(shù)，原材料來源有充足的保障。因而利用PRV為載體表達(dá)其他外源基因生產(chǎn)重組疫苗不需考慮病原生產(chǎn)工藝和材料來源方面的難題。

2.4生產(chǎn)成本低

由于PRV免疫原性好，5 000 TCID50的毒量就足以抵抗PRV強毒的攻擊，而其病毒滴度往往高于105TCID，大大降低了生產(chǎn)成本，也減少了過多外源物質(zhì)對機體的刺激。

2.5宿主范圍廣

牛、山羊、綿羊、豬、貓、狗等家畜和經(jīng)濟動物(如狐和貂)以及鹿等多種野生動物都可感染PRV，使對偽狂犬病毒載體的研究能適用于多種動物，研究價值高。

3　重組偽狂犬病毒的構(gòu)建

3.1構(gòu)建原理

重組偽狂犬病毒的構(gòu)建大致分兩部分進(jìn)行：第一步是重組質(zhì)粒的構(gòu)建。所選質(zhì)粒應(yīng)含有啟動子，并且要在其下游接表達(dá)的外源基因，有時要插入有啟動子標(biāo)記的基因如LacZ等以方便篩選，它們的兩側(cè)應(yīng)是偽狂犬病毒特異的DNA同源序列；第二步是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入偽狂犬病毒感染的細(xì)胞中，使偽狂犬病毒DNA與重組質(zhì)粒中的同源序列在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，從而將外源基因裝到偽狂犬病毒基因組的特定部位，構(gòu)建出重組病毒。

3.2轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

在構(gòu)建重組偽狂犬病病毒的研究過程中，多種轉(zhuǎn)移載體都可用來作為構(gòu)建重組病毒的工具，業(yè)界目前已有乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、狂犬病毒、豬藍(lán)耳病毒等相關(guān)基因克隆到通用載體上成功構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體的報道?？寺∞D(zhuǎn)移載體沒有優(yōu)劣之分，而是以能否正確地達(dá)到構(gòu)建的目的作為選擇標(biāo)準(zhǔn)；但為了使構(gòu)建及鑒定過程順利進(jìn)行，有時可能需要對某些載體進(jìn)行特定的優(yōu)化改造。

3.3偽狂犬基因缺失突變株的制備

在已有的研究報道中，多數(shù)學(xué)者采取了缺失gE、gI、TK基因中的一個或多個，也有部分研究對gG、gH進(jìn)行了缺失突變。試驗結(jié)果均表明，缺失這些病毒復(fù)制非必需的基因，不僅會使病毒毒力大大降低，還不會影響病毒的免疫原性和增殖程序，這使得用PRV基因缺失突變株研制活載體疫苗具有可行性。缺失其他基因是否會有同樣的作用、基因缺失與插入是否會影響病毒的增殖及免疫原性等也值得進(jìn)一步探討。

3.4轉(zhuǎn)染方法

一般采用磷酸鈣法和脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。磷酸鈣法可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細(xì)胞，不但適用于短暫表達(dá)，也可生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。但對轉(zhuǎn)染過程要求較嚴(yán)格，整個轉(zhuǎn)染過程中都應(yīng)無菌操作，確保形成盡可能細(xì)小的沉淀物，在試驗中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)。由于磷酸鈣法要求很嚴(yán)格，而脂質(zhì)體法相對來說更簡單，所以用脂質(zhì)體法相對較普遍。

脂質(zhì)體法具有操作簡便，轉(zhuǎn)化效率高的特點，可以用于瞬時轉(zhuǎn)染，也可以用在永久表達(dá)系的建立，對細(xì)胞類型的運用面廣，對轉(zhuǎn)染的核酸類型和分子質(zhì)量有很高的包容性，細(xì)胞毒性小，也可以用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染。因此脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法得到了越來越廣泛的應(yīng)用。但轉(zhuǎn)染溫度、時間、DNA與脂質(zhì)體的比率等對轉(zhuǎn)染均有影響，其中DNA與脂質(zhì)體的比率是關(guān)鍵。

3.5篩選方法

目前基因重組研究中常用β-半乳糖苷酶基因(LacZ)和綠色熒光蛋白基因(GFP)作為報告基因?qū)χ亟M病毒進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化。運用插入報告基因的方法，將LacZ基因或者抗生素基因等與外源基因同時導(dǎo)入偽狂犬病毒基因組中，通過在培養(yǎng)液中加入Xgal、G418等試劑，篩選出重組病毒。

報告基因的應(yīng)用使得重組子的篩選非常方便。GFP既對細(xì)胞沒有損害，且直觀易用，與其他標(biāo)記物相比具有更高的靈敏度和分辨率。而LacZ常被用于轉(zhuǎn)化菌株的篩選。此兩種報告基因，均有方便直觀的特點，目前在偽狂犬病病毒活載體疫苗的研究中常被用到[5]。

3.6外源基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)

目前，構(gòu)建重組偽狂犬病毒所選用的主要是gG、gE啟動子，其結(jié)構(gòu)獨特且活性較強，另外還有g(shù)D、CMV。一般說來，啟動子序列距外源基因起始密碼子越近時表達(dá)效果越好。

3.7構(gòu)建重組病毒注意事項

復(fù)制非必需區(qū)TK、gG、gE基因是目前應(yīng)用較多的同源序列。再者，選用的親本病毒株最好是目前常規(guī)使用的疫苗株，從而才能夠不引起宿主發(fā)病；再就是考慮其親本株的宿主特異性，以對其他動物不構(gòu)成威脅為前提。最后還要考慮到它所誘導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答的類型，是全身性免疫應(yīng)答還是局部的黏膜免疫應(yīng)答，以便構(gòu)建對應(yīng)類型的重組載體，研制適用的重組疫苗[6]。

4　?國內(nèi)外偽狂犬病毒表達(dá)載體的研究進(jìn)展

自1984年首次報道可以將HSV-1作為表達(dá)外源基因的載體以來，皰疹病毒作為載體得到了深入研究和廣泛應(yīng)用。PRV的基因結(jié)構(gòu)和功能與單純皰疹病毒的很相似，這就為PRV在載體方面研究提供了模型。Keeler C L等[7]最早用PRV作為載體表達(dá)了g-β-半乳糖苷融合蛋白。Thomsen D R等[8]在PRV gG基因的啟動子下游插入人組織血纖維蛋白溶酶原激活物(tPA)編碼的cDNA，并用免疫沉淀分析法和細(xì)胞培養(yǎng)中酶活性檢測出了表達(dá)的tPA。自此以PRV作為表達(dá)載體的研究就拉開了序幕。

郭萬柱等[9]首次構(gòu)建了PRV Fa 株TK基因缺失株，PRV Fa gI-/gp63-基因缺株，PRV Fa gI-/gp63-/LacZ基因缺失株，還構(gòu)建了PRV TK-和PRV gp63-/LacZ轉(zhuǎn)移載體，又將構(gòu)建的gP631acZ轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與PRV Fa DNA經(jīng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染，在MDBK細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得PRV Fa gE-/gI-/ TK-/LacZ三基因缺失疫苗株(PRVSA215)，PRV-SA215是我國首次成功研制出的Fa-/gI-/TK-/LacZ三基因缺失疫苗株，標(biāo)志我國在基因工程疫苗研制的領(lǐng)域上取得了重大突破。

方六榮等[10]對含偽狂犬病毒(PRV) 鄂A株gG全基因，PK、gD基因部分編碼序列的質(zhì)粒pUSK進(jìn)行改造，消除了其中的EcoR1位點，將通過PCR擴增的增強綠色熒光蛋白基因(EGFP)融合到gG啟動子下游，構(gòu)建了由gG啟動子控制EGFP表達(dá)的PRV轉(zhuǎn)移載體pgG-/EGFP+，該轉(zhuǎn)移載體單獨轉(zhuǎn)染或同PRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，結(jié)果單獨轉(zhuǎn)染時EGFP不能表達(dá)；共轉(zhuǎn)染時，6 h就可在熒光顯微鏡下觀察到明顯的熒光。

Liu Z等[11]將LacZ基因表達(dá)試劑盒插入到PRV Ea株基因組的gE區(qū)，通過藍(lán)斑篩選和純化，得到了TK-/ gE-/LacZ+PRV。利用LacZ基因處的EcoRI酶切位點來消化PRV Ea TK-/gE-/LacZ+基因組DNA，并與質(zhì)粒pFBBS在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。經(jīng)過蝕斑純化得到了TK-/gE-/ gDPRV。通過小鼠試驗表明，此TK-/ gE-/gD-PRV的毒力明顯減弱。

錢平[12]等將來自質(zhì)粒pFSV40的300 bp BamHI / PstI片段[其中含有SV40 poly(A)和部分多克隆位點]插入到質(zhì)粒pUSK相應(yīng)的酶切位點中，獲得重組質(zhì)粒pUSKSV40，該重組質(zhì)粒中g(shù)G基因5’端編碼區(qū)缺失了428bp。將來自質(zhì)粒pcDNA3.l(+)的946bp Bgl II EcoRI片段(其中含CMV啟動子及部分多克隆位點)插入到質(zhì)粒pUSKSV40的BamHI EcoRI位點，構(gòu)建了通用載體pPRVCMV-uni，其中含有CMV啟動子、SV40 poly(A)以及NheI、Pmel、BamHI、BstXI、EcoRI、StuI、XbaI等7個單一克隆位點。將eGFP基因插入到該通用載體的BamHI 和EcoRI之間，用所獲得的轉(zhuǎn)移載體與TK-/gG-/Lacz+PRV基因組共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)檢測eGFP基因在重組偽狂犬病病毒中獲得表達(dá)，從而證實了此通用載體構(gòu)建的可行性。

黃偉堅等[13]以偽狂犬病病毒SH株細(xì)胞培養(yǎng)物為模板，用PCR方法擴增蛋白激酶(PK)基因部分片段，克隆到pCDNA3中，序列測定顯示所擴增的PK基因片段長907 bp，與PRV NIA-3株的核苷酸同源性為99.6%。把PK基因克隆到pUC19上，利用PK基因中間的SalI酶切位點，插入帶有綠色熒光蛋白(EGFP)的基因表達(dá)盒，構(gòu)成了含EGFP的轉(zhuǎn)移載體，為PK基因的功能和構(gòu)建PK缺失株的進(jìn)一步研究提供了參考。

胡濤等[14]參考GenBank收錄的偽狂犬病病毒gD基因的序列設(shè)計了一對引物，對PRV Min-A株進(jìn)行了PCR擴增，擴增產(chǎn)物克隆于pGEM-T Easy載體。對重組質(zhì)粒PGTE-gD 進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析和基因測序，證實了克隆片段的可靠性。測序結(jié)果表明目的片段包含一個1 203 bp的開放性閱讀框(ORF)，編碼400個氨基酸組成的多肽。將gD基因亞克隆至真核表達(dá)載體pcDVA3.1-的CMV啟動子下游，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-gD，為下一步基因免疫奠定了基礎(chǔ)。

Xu G等[15]構(gòu)建了表達(dá)乙型腦炎病毒NS1基因的重組PRV 株TK-/gG-/ NS1+。經(jīng)檢測，重組病毒能表達(dá)具有生物活性的NS1蛋白，有望作為豬乙型腦炎和偽狂犬病雙價基因工程疫苗。

呂素芳等[16]根據(jù)偽狂犬病病毒SA株的gI和gE基因序列，設(shè)計兩對引物，缺失掉gE基因5’端738bp，在克隆測序的基礎(chǔ)上，采用酶切方法構(gòu)建了含部分gE基因的轉(zhuǎn)移載體pBgIE，同時將pBLYFP載體上含CMV啟動子、多克隆位點、黃色熒光蛋白(YFP)基因和poly A尾巴的表達(dá)盒雙酶切后插入到缺失位置，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體，命名為pBgIE-YFP。

徐志文等[17]將包含有完整閱讀框架的豬細(xì)小病毒VP 2基因(1740 bp)和豬圓環(huán)病毒2型ORF 2基因(750 bp)插入到真核表達(dá)載體pPI-2.EGFP中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒的DNA和PRV SA2l5株的DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后20 h出現(xiàn)帶熒光的空斑，挑斑純化后繁殖，并收獲病毒液后通過PCR和免疫熒光試驗證實，成功構(gòu)建了重組病毒，將其命名為PRV SA215(D1)株。

5　?展望

偽狂犬病毒雖然在過去的十幾年時間里依靠缺失疫苗的應(yīng)用得到有效的控制，但是近年來偽狂犬在各個地區(qū)時常有所發(fā)生。所以當(dāng)前對偽狂犬病毒侵染機體突破疫苗產(chǎn)生免疫防護的機制的研究仍然需要深入。隨著對偽狂犬病毒研究的逐步深入，其作為重組表達(dá)載體的類型也越來越豐富。因偽狂犬病毒具備外源基因容量大、安全性好、免疫期長、宿主范圍廣、低成本、人類對偽狂犬病病毒沒有易感性等特點，可以用于制備二價或多價基因工程疫苗，這樣的疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫比較廣泛，包括體液免疫和

細(xì)胞免疫、甚至黏膜免疫，可以避免重組亞單位疫苗的很多缺點。由于偽狂犬載體可以同時插入多個外源基因，若能成功插入外源抗原基因且保持載體穩(wěn)定，就有望達(dá)到一針防治多病的目的，進(jìn)而作為未來疫苗研制與開發(fā)的熱點和主要方向之一。此外，PRV表達(dá)載體還將會在基因表達(dá)，基因投遞，基因治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景。不可否認(rèn)，利用偽狂犬載體研制多價基因工程疫苗還需要解決一系列安全性方面的問題，且要與病原特性、發(fā)病機理、免疫保護機制及病毒感染的流行病學(xué)特點相兼顧，但相信經(jīng)過進(jìn)一步的研究，以偽狂犬病病毒為載體研制出的新型疫苗，將會為動物疫病的防控提供強有力的技術(shù)支撐。

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(收稿日期：2015-11-02)

*通訊作者，朱玲，E-mail:abtczl72@ 126.com。

作者簡介：趙軍（1991-），男，四川瀘州人，在讀碩士研究生，研究方向為動物傳染病病原分子生物學(xué)

基金項目：本研究受長江學(xué)者發(fā)展計劃（IRT13083）、新世紀(jì)優(yōu)秀人才計劃（NCET 11-1059）、四川省科技支撐計劃（2013NZ0016）、四川省青年科技創(chuàng)新研究團隊培育計劃（2013TD0015） 資助