田曉蓓　黎　婷　宋文婷　孫晉虎

(徐州醫(yī)學院口腔醫(yī)學院,江蘇　徐州　221004)

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人牙髓干細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子表達與低氧預(yù)處理的關(guān)系

田曉蓓黎婷宋文婷孫晉虎

(徐州醫(yī)學院口腔醫(yī)學院,江蘇徐州221004)

〔摘要〕目的探討人牙髓干細胞(hDPSCs)增殖及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達與低氧預(yù)處理的關(guān)系。方法收集健康完整恒牙，采用組織塊酶消化法培養(yǎng)hDPSCs，取3～5代生長良好的hDPSCs分為低氧組(30 ml/O2)和常氧組(210 ml/O2)培養(yǎng)，采用MMT、qRT-PCR和ELISA等技術(shù)檢測細胞增殖、VEGF表達量。結(jié)果低氧組培養(yǎng)第2、3天hDPSCs的增殖活性O(shè)D值分別為(0.69±0.13)和(0.90±0.22)，明顯高于常氧組(P<0.05)；低氧組和常氧組培養(yǎng)第1、4天hDPSCs增殖活性O(shè)D值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后，低氧組細胞形態(tài)仍呈長梭形，同常氧組的細胞形態(tài)相似，兩組細胞活性良好，均未發(fā)現(xiàn)有細胞壞死的現(xiàn)象發(fā)生；低氧組培養(yǎng)24、48和72 h VEGF mRNA相對表達量分別為(2.47±0.08)、(15.07±2.10)和(4.10±0.12)，明顯高于常氧組(P<0.05)；低氧組培養(yǎng)24、48和72 h VEGF表達量分別為(598.10±43.18)、(674.84±23.32)和(802.31±23.07)pg/ml，明顯高于常氧組(P<0.05)。結(jié)論低氧預(yù)處理能顯著促進hDPSCs增殖及VEGF表達，提示低氧預(yù)處理可能對hDPSCs體內(nèi)移植有利。

〔關(guān)鍵詞〕人牙髓干細胞；低氧預(yù)處理；血管內(nèi)皮生長因子；細胞增殖

第一作者：田曉蓓(1979-)，女，碩士，講師，主要從事牙體牙髓病學研究。

低氧環(huán)境普遍參與機體生理病理的發(fā)生發(fā)展過程，參與胚胎及多種疾病的發(fā)生中，相關(guān)基礎(chǔ)領(lǐng)域研究特別是腫瘤微環(huán)境理論認為，間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)適宜生長環(huán)境為輕度缺氧環(huán)境，牙髓干細胞作為間充質(zhì)干細胞，在人體內(nèi)的生長同樣需求低氧環(huán)境〔1，2〕。近年來相關(guān)牙髓干細胞體外分析研究多數(shù)采用常氧環(huán)境，而部分學者認為，體外低氧環(huán)境下培養(yǎng)牙髓干細胞能顯著促進細胞增殖，增加移植成功率，并認為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過自身水平的顯著變化，進而促進低氧環(huán)境下牙髓干細胞的增殖〔3，4〕。本研究重在探討人牙髓干細胞(hDPSCs)增殖及VEGF表達與低氧預(yù)處理的關(guān)系。

1材料與方法

1.1hDPSCs分離培養(yǎng)收集患者因阻生或正畸需要拔除的健康完整恒牙，采用組織塊酶消化法培養(yǎng)hDPSCs，當原代細胞長滿瓶底超過80%時，行常規(guī)傳代并擴大培養(yǎng)。

1.2hDPSCs分組培養(yǎng)取3～5代生長良好的hDPSCs接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，隨機分入低氧組(30 ml/O2)和常氧組(210 ml/O2)中培養(yǎng)，其中低氧組氧體積分數(shù)從210 ml/O2降至30 ml/O2時間約為2 min，當氧體積分數(shù)穩(wěn)定至30 ml/O2后分別培養(yǎng)24、48、72 h。

1.3MTT法檢測hDPSCs增殖取第3～5代牙髓干細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板(3×103)，分為常氧組和低氧組進行培養(yǎng)，每孔設(shè)置5個復孔，分為培養(yǎng)1、2、3、4 d，每孔加入20 μl MTT(南京凱基生物科技有限公司，濃度：5 mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4 h，去除上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，使用酶標儀(上海華科儀器有限公司 型號：BS-1101)測定波長為490 nm OD值。

1.4細胞活性檢測細胞經(jīng)過相關(guān)培養(yǎng)后加入PI/Calcein-AM混合熒光染色液，37℃孵育15～30 min，去除染色液，PBS漂洗一次，顯微鏡下觀察(死細胞染色為紅色，活細胞為黃綠色)。

1.5hDPSCs表達VEGF檢測VEGF轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達差異采用Q-PCR和ELISA檢測，所有試劑均購自南京凱基生物科技有限公司，相關(guān)檢測方法嚴格按照說明書。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1hDPSCs的生長及形態(tài)采用組織塊酶消化法培養(yǎng)分離得到hDPSCs，約在第6～8天從牙髓組織塊邊緣游出，倒置顯微鏡可見細胞呈長梭形、成纖維樣細胞形態(tài)，胞質(zhì)豐滿，胞核清晰，細胞核橢圓居中，平均3～5 d傳代一次，隨著生長密度增加，細胞呈放射狀或渦旋狀排列。見圖1。

圖1　hDPSCs鏡下觀察

2.2hDPSCs增殖情況低氧組培養(yǎng)第2、3天hDPSCs增殖活性O(shè)D值明顯高于常氧組(P<0.05)；低氧組和常氧組培養(yǎng)第1和4天hDPSCs增殖活性無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.3細胞活性檢測hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后，低氧組細胞形態(tài)仍呈長梭形，同常氧組的細胞形態(tài)相似，兩組細胞活性良好，均未發(fā)現(xiàn)有細胞壞死。

2.4hDPSCs VEGF蛋白及mRNA表達情況低氧組培養(yǎng)24 h、48 h和72 h VEGF蛋白和mRNA相對表達量明顯高于常氧組(P<0.05)，見表2和3。

表1　兩組hDPSCs增殖活性O(shè)D值情況

表2　兩組VEGF mRNA相對表達量比較

表3　兩組VEGF表達比較

3討論

hDPSCs為存在于人牙髓組織中的間充質(zhì)干細胞，相關(guān)組織微環(huán)境理論認為，間充質(zhì)干細胞具有自我增殖和多向分化潛能，臨床上普遍采用從拔出的第三磨牙等牙組織中獲取hDPSCs，由于其來源于自身組織，相關(guān)移植免疫反應(yīng)較輕，是較為理想的牙髓再生研究的細胞株〔5〕。目前多數(shù)研究仍采用體外常氧環(huán)境對于hDPSCs進行培養(yǎng)研究，劉偉等〔4〕發(fā)現(xiàn)，常氧培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞經(jīng)過移植后，組織缺血缺氧的發(fā)生率較高，約65%細胞發(fā)生凋亡。而聶姍姍等〔6〕發(fā)現(xiàn)，在采用濃度為30 ml/O2的低氧預(yù)先處理hDPSCs后，細胞存活率顯著增加，同時組織發(fā)生缺血壞死的比例呈現(xiàn)降低趨勢。文軍等〔7〕認為，低氧環(huán)境預(yù)先處理hDPSCs后，可能通過刺激VEGF生成，進而促進細胞存活，提高移植成功率。低氧是牙髓干細胞較為適宜的生長環(huán)境〔8，9〕。Kuo等〔10〕發(fā)現(xiàn)，采用濃度為40 ml/O2預(yù)先處理牙髓間充質(zhì)干細胞后發(fā)現(xiàn)，細胞增殖活力及活性均較為理想，同時細胞形態(tài)較為典型，無明顯細胞凋亡及細胞碎片。 Gu等〔11〕通過MTT測定hDPSCs細胞在40 ml/O2低氧環(huán)境中增殖效應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)中段時間內(nèi)，OD值所測得的hDPSCs增殖活力較為顯著，明顯高于常氧環(huán)境中的細胞。Kuo等〔10〕通過低氧處理hDPSCs后發(fā)現(xiàn)，在低氧處理的3 d內(nèi)，細胞在450 nm波長處吸光度值明顯高于常氧對照組，而 Pisciotta等〔12〕認為，在細胞增殖、再生中具有重要前驅(qū)性作用的VEGF可能顯著參與低氧促細胞增殖、生長的機制中。Gao等〔13〕發(fā)現(xiàn)，低氧處理的hDPSCs其VEGF轉(zhuǎn)錄水平表達顯著上調(diào)，但蛋白水平未予研究。本研究提示VEGF可能顯著參與低氧的促增殖效應(yīng)中。血管再生是牙髓移植的重要組成部分，而VEGF在血管的發(fā)生和形成中發(fā)揮了中樞性的作用。張男等〔14〕認為，血管再生及血供的及時建立能有效提高細胞移植的成功率，并認為VEGF所介導的內(nèi)皮細胞增殖、分化和遷移是血管內(nèi)皮再生的最重要調(diào)節(jié)因素。史欣〔15〕也認為，VEGF所介導的血管再生作用在低氧促牙髓移植成功的機制中發(fā)揮了重要作用。

綜上，體外低氧環(huán)境可以促進hDPSCs增殖，通過低氧環(huán)境預(yù)先處理需要移植的細胞能顯著增加移植成功率，VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的上調(diào)可能顯著參與血管再生調(diào)節(jié)過程中，進而提高移植成功率，但相關(guān)具體機制仍需進一步探討。

4參考文獻

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〔2014-09-25修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：孫晉虎(1969-)，男，博士，教授，主要從事口腔頜面疾病研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(No.31060167);徐州市科技項目(No.kc14sh114);江蘇青藍工程學術(shù)帶頭人資助項目(2014)

〔中圖分類號〕R31

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6328-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.004