NO前體藥物JS-K體外對乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影響

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NO前體藥物JS-K體外對乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影響

王歡1,2，周艷萌2，勾英2，劉正蕓3，惠景1，劉杰3

(遵義醫(yī)學院1. 醫(yī)學與生物學研究中心； 2. 微生物學教研室；3.基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察一氧化氮前體藥物JS-K體外對乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影響。方法 以攜帶有HBV基因組的HepG2.2.15細胞作為研究工具，MTT法檢測JS-K(0、1、2、5、10 μM)對細胞的毒性作用；熒光染色檢測JS-K作用于細胞后一氧化氮的釋放情況；ELISA及免疫熒光結合激光共聚焦顯微鏡檢測的方法，檢測不同濃度JS-K對細胞中HBsAg和HBeAg表達的影響。結果 包括最高濃度組(10 μM)在內(nèi)的各濃度JS-K對細胞均無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；JS-K作用于細胞24 h后，細胞內(nèi)一氧化氮的釋放明顯增多；隨著JS-K濃度的增高，HBsAg的表達明顯降低，HBeAg的表達有一定的減少。結論 一氧化氮前體藥物JS-K在體外對乙肝病毒的抗原有一定的抑制作用。

[關鍵詞]一氧化氮；JS-K；乙型肝炎病毒

目前乙肝的抗病毒治療藥物主要有干擾素和核苷類似物[1]，這些治療方法主要是通過抑制病毒復制中的關鍵酶類而干預病毒復制過程，或者針對宿主抗病毒的不同環(huán)節(jié)而發(fā)揮抗病毒作用。這些藥物雖有一定的療效，但也存在病毒不易被完全清除、停藥后反跳等不良反應，而且針對核苷類似物的耐藥性也逐漸增加。因此，新型抗乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)藥物的研究具有重要意義。一氧化氮(nitric oxide, NO)主要是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產(chǎn)生的一種氣態(tài)自由基，具有維持血管張力的恒定、調節(jié)血壓穩(wěn)定及腦血流、促進記憶過程、殺傷細菌病毒及腫瘤細胞等多種生物學功能。JS-K是一種具有特定靶向性的偶氮鎓二醇鹽類NO供體藥物[2](也稱前體藥物)，它能在谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)作用下釋放定量的NO。為了尋找新型抗HBV藥物，因此我們以HepG2.2.15細胞作為工具，對JS-K的抗HBV活性進行了評價，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料細胞：HepG2.2.15細胞購于湘雅醫(yī)學院，由本室保存。主要試劑：JS-K由Dr. Keefer (NCI at Frederick)教授惠贈；DMEM培養(yǎng)基以及進口胎牛血清購于Hyclone公司；MTT、DAF-FM DA(一氧化氮熒光探針)以及DAPI購于碧云天生物技術公司；HBsAg和HBeAg的ELISA檢測試劑盒均為中山大學達安基因股份有限公司產(chǎn)品；HBsAg及HBeAg抗體購于博奧森生物技術公司。

1.2實驗方法

1.2.1JS-K對HepG2.2.15細胞的毒性實驗將對數(shù)生長期的HepG2.2.15細胞消化后接種于96孔板中，細胞濃度為5×103個/100 μL/孔；次日待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的JS-K，每組設6個平行孔，然后將板置于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔中液體，加入DMSO，100 μL/孔，輕輕搖晃，使其結晶物充分溶解，用全自動酶標儀檢測OD490的值，并按下述公式計算細胞存活率。

細胞存活率=實驗組平均 OD 值/對照組平均 OD值

1.2.2NO檢測將HepG2.2.15細胞接種于petri皿中，次日待細胞貼壁后加入終濃度為10 μM的JS-K，作用24 h后用于NO的檢測。按照說明書，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA，至終濃度為5 μM。棄去皿中的培養(yǎng)液，加入500 μL稀釋后的DAF-FM DA，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，PBS洗3次，以除去未進入細胞內(nèi)的DAF-FM DA。將皿置于激光共聚焦顯微鏡下(激發(fā)波長：495 nm，發(fā)射波長：515 nm)檢測熒光的情況。

1.2.3ELISA法檢測HBsAg和HBeAg不同濃度的JS-K作用于HepG2.2.15細胞72 h后收集各組上清用于HBsAg和HBeAg的檢測，具體檢測步驟按照試劑盒說明書進行，最后在波長450 nm下檢測各組吸光度。

1.2.4免疫熒光法檢測HBsAg和HBeAg的表達用4%多聚甲醛對JS-K作用后的HepG2.2.15細胞在室溫下固定10 min，PBS清洗3次。0.1% Triton X-100作用10 min，PBS清洗3次；封閉液室溫孵育30 min后，加入適量稀釋后的一抗，置于濕盒中4 ℃過夜，PBS清洗3次；避光滴加熒光素標記的二抗，置于濕盒中室溫1 h，PBS清洗3次；DAPI復染細胞核，PBS清洗3次，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2結果

2.1JS-K對HepG2.2.15細胞的毒性作用由圖1可見，與對照組比較，各濃度組的細胞存活率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示JS-K在濃度10μM以內(nèi)對HepG2.2.15細胞無明顯毒性作用。

圖1　JS-K對HepG2.2.15細胞生長的影響

2.2JS-K對NO水平的影響用特異性熒光探針DAF-FM DA標記細胞內(nèi)的NO后，對照組細胞具有較弱的綠色熒光，即胞內(nèi)NO水平較低，10μM的JS-K作用24 h后細胞內(nèi)的熒光信號明顯高于對照組，提示作為NO前體的JS-K作用于細胞后，導致細胞內(nèi)NO水平明顯升高(見圖2)。

2.3JS-K對HepG2.2.15細胞HBsAg表達的影響不同濃度的JS-K作用于HepG2.2.15細胞72h后，用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中HBsAg的表達情況，結果顯示：隨著JS-K濃度的增高，HBsAg的表達明顯降低，當JS-K濃度達到10μM時，HBsAg的表達量降低了70%以上(見圖3)；同時，通過免疫熒光，利用激光共聚焦顯微鏡檢測顯示HBsAg(綠色熒光)主要表達在胞漿，JS-K作用后HBsAg明顯減弱(見圖3)，提示JS-K有非常顯著的抑制HBsAg的作用。

A:對照組；B：JS-K組。圖2　JS-K對NO表達的影響(×630)

A:對照組；B：JS-K組；各濃度組與對照組比較，* P<0.05，** P<0.01。圖3　JS-K對HepG2.2.15細胞HBsAg表達的影響

2.4JS-K對HepG2.2.15細胞HBeAg表達的影響不同濃度的JS-K作用于HepG2.2.15細胞72h后，用ELISA檢測細胞上清中HBeAg的表達情況。結果顯示：隨著JS-K濃度的增高，HBeAg的表達明顯降低，當JS-K濃度達到5μM時，HBeAg的表達量降低了30%左右，而隨著用藥濃度的進一步增高(>5μM)，HBeAg的表達并未繼續(xù)降低，而是基本維持在與5μM時的相似水平(見圖4)，提示JS-K在一定范圍內(nèi)具有抑制HBeAg表達的作用。同時，免疫熒光結果也顯示，HBeAg(綠色熒光)在胞漿和胞核中都有表達，但大多集中在胞漿中近胞核處，JS-K作用后，HBeAg的表達有一定減弱(見圖4)。

A:對照組；B：JS-K組；各濃度組與對照組比較，* P<0.05，** P<0.01。圖4　JS-K對HepG2.2.15細胞HBeAg表達的影響

3討論

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相關性疾病已成為當今威脅人類健康的主要疾病之一。目前針對乙肝的抗病毒治療藥物主要有核苷類似物及干擾素。這些藥物雖有一定療效，但也存在不良反應，而且針對核苷類似物的耐藥性也逐漸增加。因此，新型抗HBV藥物的研究具有更重要的意義。

NO在體內(nèi)主要是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產(chǎn)生的一種氣態(tài)自由基，具有維持血管張力的恒定、調節(jié)血壓穩(wěn)定及腦血流、促進記憶過程、殺傷細菌病毒及腫瘤細胞等多種生物學功能。早在十多年前Reiss CS等[3]就總結了NO能夠抑制多種病毒的復制，包括：脊髓灰質炎病毒、小鼠肝炎病毒、流感病毒、水皰性口炎病毒、單純皰疹病毒(Ⅰ型)、EB病毒、獲得性免疫缺陷病毒(HIV)以及HBV等等。

JS-K作為NO供體藥物，它能在谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)作用下釋放定量的NO，以在腫瘤細胞中過度表達的GSTs為靶點，與GSTs結合，抑制GSTs的活性，在靶細胞中釋放NO而發(fā)揮殺細胞效應，因此目前其研究主要集中于抗腫瘤方面，如：肝癌細胞、結腸癌細胞、白血病細胞、前列腺癌細胞、乳腺癌細胞以及肺癌細胞等[4-13]。對于腫瘤細胞，JS-K主要產(chǎn)生兩方面的作用：一方面釋放NO，直接殺滅腫瘤細胞；另一方面，JS-K在細胞內(nèi)耗竭GSH與GST，從而削弱細胞對化療藥物的外排作用。

有關JS-K在病毒性疾病中的研究尚未見報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)了JS-K有潛在抗HBV的作用：它能在細胞中產(chǎn)生NO，引起HBsAg和HBeAg的分泌減少，尤其是對HBsAg的抑制?，F(xiàn)有研究認為NO抑制病毒復制的機制主要集中于：一方面NO能夠影響含鐵和巰基的蛋白的功能，如：鳥苷酸環(huán)化酶、核苷酸還原酶、順烏頭酸酶和線粒體電子傳遞酶等[14]，使酶活性受到抑制，從而阻斷了細胞內(nèi)能量和DNA的合成，引起細胞毒性效應，抑制病毒增殖；另一方面，NO能與超氧陰離子(O2-)作用生成具有強氧化作用的過氧化亞硝基陰離子ONOO-，它能氧化酶與蛋白質等，使之硝基化并滅活酶活性，造成細胞代謝紊亂。

因此，從本研究結果看來，可推測JS-K抗HBV的效應可能與JS-K和細胞內(nèi)GST結合后釋放NO有著重要關系，但釋放的NO抑制HBV相關抗原分泌的機制究竟是使病毒的RNA、DNA以及蛋白質的合成受到抑制，還是使病毒的結構蛋白被硝基化，又或者是其他什么原因，值得進一步研究。

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[收稿2015-04-11;修回2015-05-27]

(編輯：譚秀榮)

基礎醫(yī)學研究

Experimental study of nitric oxide prodrug JS-K on inhibiting HBsAg and HBeAg in vitro

WangHuan1,2,ZhouYanmeng2,GouYing2,LiuZhengyun3,HuiJing1,LiuJie3

(1.Research Center for Medicine & Biology，Zunyi Guizhou 563099, China ;2.Department of Microbiology，Zunyi Guizhou 563099, China;3.Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China )

[Abstract]Objective To test the effect of nitric oxide prodrug JS-K in vitro against HBsAg and HBeAg. Methods HepG2.2.15 Cells with the HBV Gene were used to detect the cytotoxic effect of JS-K (0，1，2，5，10 μM) in killing HBV-containing cells.The release of NO after JS-K was determined by fluorescent staining; the expression of HBsAg and HBeAg was examined by ELISA and immunofluorescence combined with confocal laser scanning.Results Under the concentration of 10 μM, JS-K have no obvious toxic action on cells (P﹥0.05);When the concentration of JS-K was increased, the expression of HBsAg was decreased and the expression of HBeAg was also reduced.Conclusion Nitric oxide prodrug JS-K has the inhibitory activity on HBV antigen in vitro.

[Key words]nitric oxide;JS-K;hepatitis B virus

[文獻標志碼][中圖法分類號] R575.1 A

[文章編號]1000-2715(2015)03-0226-04

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(NO：81360261)；貴州省科學技術基金資助項目(NO：黔科合J字LKZ[2013]08)；遵義醫(yī)學院博士啟動基金資助項目(NO：F-578)。