紫花苜蓿種子萌發(fā)對鈷脅迫的生理生化響應

張虎,寇江濤,師尚禮*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿種子萌發(fā)對鈷脅迫的生理生化響應

張虎1,2,寇江濤1,2,師尚禮1,2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

摘要：以“甘農(nóng)3號”紫花苜蓿為試驗材料，研究不同濃度Co2+(0，0.25，0.50，1.00，2.50，5.00 mmol/L CoCl2)脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生理生化特性的影響。結果表明：Co脅迫對紫花苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗的生長有明顯的抑制作用，隨著Co脅迫濃度的增大，種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及幼苗的胚芽長、胚根長、根系活力和干重均顯著降低，而且Co脅迫對發(fā)芽勢的抑制作用大于發(fā)芽率，對胚根生長的抑制作用大于胚芽；低濃度Co脅迫(0.25和0.50 mmol/L)下，苜蓿幼苗葉片中可溶性蛋白、可溶性糖含量和蛋白水解酶、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)活性與CK均無顯著差異，而游離脯氨酸含量顯著升高；隨著Co脅迫濃度的升高，可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸含量及蛋白水解酶、SOD、APX、GPX、CAT活性均顯著下降，超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生速率、羥自由基(OH·)濃度、H2O2及丙二醛(MDA)含量均顯著增加。說明高濃度Co脅迫使得苜蓿幼苗抗氧化系統(tǒng)活性下降，活性氧清除能力降低，膜脂過氧化程度加劇，從而抑制了紫花苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗的生長。

關鍵詞：鈷脅迫；紫花苜蓿；種子萌發(fā)；幼苗生長；抗氧化酶；滲透調節(jié)；活性氧

Physiological and biochemical responses ofMedicagosativaseed to cobalt stress

ZHANG Hu1,2, KOU Jiang-Tao1,2, SHI Shang-Li1,2*

1.CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.KeyLaboratoryofEcosystemMinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-USCenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

Abstract:The aim of this study was to investigate the mechanism of cobalt (Co) stress damage on Medicago sativa as experiment materials, The effects of different concentrations (0, 0.25, 0.50, 1.00, 2.50, 5.00 mmol/L CoCl2) of Co on M. sativa (cv. Gannong No.3) seed germination and seedling physiological and biochemical characteristics were assessed. The results indicate that Co stress significantly inhibited seed germination and seedling growth. Seed germination potential, germination rate, germination index, vigor index, seedling sprout length, radicle length, root activity and dry weight were significantly reduced with increasing cobalt concentration. The inhibitory effects of Co stress on germination potential was higher than that of cobalt stress on germination rate, and the inhibitory effects of Co stress on radical growth was higher than that on the plumule. Co significantly reduced the soluble protein content, soluble sugar content, proteolytic enzyme activity, superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPX) and catalase (CAT) in seedling leaves. However free proline content increased dramatically at lower Co concentrations but declined at higher concentrations. At higher Co concentrations, O2·-(superoxide anion radical), OH·(hydroxyl radical), H2O2and malondialdehyde increased significantly. This illustrates that under high Co stress, the seedling antioxidant system activity and active oxygen scavenging ability of M. sativa decreased, inhibiting M. sativa seed germination and seedling growth.

Key words:cobalt stress; Medicago sativa; seed germination; seedling growth; antioxidant enzyme; osmotic adjustment; active oxygen

土壤是人類賴以生存的自然環(huán)境要素和重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資源，人類活動的不斷增加導致全球土地重金屬污染越來越嚴重，并嚴重危害著人類自身的健康，因此，近年來治理重金屬污染成為國際科學界研究的熱點問題[1]。鈷(Co)是動植物體生長發(fā)育所必需的微量營養(yǎng)元素之一，對保持生物機體的正常代謝功能必不可少[2]，其在土壤中廣泛存在并參與豆科植物的根瘤固氮[3-4]，在植物的礦質營養(yǎng)中通常作為植物生長發(fā)育的有益元素而發(fā)揮作用，對多種植物具有提高產(chǎn)量、改善品質的作用[5]。

調查表明，世界土壤鈷的平均含量范圍一般在0.05~300 mg/kg之間，大多數(shù)土壤鈷含量范圍為2~40 mg/kg，目前多引用10 mg/kg[6]。我國土壤中鈷含量的變幅較大，一般為0.57~104 mg/kg，大部分土壤鈷含量在5~40 mg/kg之間。我國土壤鈷的背景值為11.6 mg/kg，且南北方差異較大，北方土壤鈷含量高、變幅小，一般范圍為12~35 mg/kg，南方則從痕量到200 mg/kg[7-8]。鈷雖然植物生長的必需微量營養(yǎng)元素，在植物的生長過程中有重要的作用[9]，但土壤中過量的鈷會阻滯植物的生長發(fā)育并使之受到毒害[10]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為多年生的高產(chǎn)、優(yōu)質豆科經(jīng)濟作物，具有生長速度快、生活史短、地上部及根系生物量大等特點，但有關鈷脅迫對紫花苜蓿萌發(fā)、生長及生理生化的影響還缺乏研究。本文以紫花苜蓿為材料，研究不同濃度鈷脅迫對紫花苜蓿種子發(fā)芽及幼苗生理生化特性的影響，旨在探明鈷脅迫對紫花苜蓿幼苗的傷害機理，為明確紫花苜蓿對鈷脅迫的耐性機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　供試材料及處理

供試品種為甘農(nóng)3號紫花苜蓿(M.sativacv. Gannong No.3)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。

試驗于2012年在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室進行。試驗選取飽滿均勻的苜蓿種子，用0.1% HgCl2溶液消毒 5 min，去離子水沖洗3~4次，吸水紙吸干，置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100粒種子，將培養(yǎng)皿置于種子發(fā)芽箱中[光通量密度70 μmol/m2·s，溫度(25±1)℃，相對濕度80%]進行發(fā)芽。試驗藥品為CoCl2，設6個Co2+脅迫濃度，分別為0(CK：蒸餾水)，0.25，0.50，1.00，2.50，5.00 mmol/L，每個處理重復6次，為保證處理濃度穩(wěn)定，每隔24 h更換1次處理液。

自種子發(fā)芽之日起，每日觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)(以胚根伸出種皮作為發(fā)芽標準)，于處理第4天時統(tǒng)計種子的發(fā)芽勢，測定可溶性蛋白、可溶性糖及游離脯氨酸含量、蛋白水解酶活性；第10天時統(tǒng)計種子的發(fā)芽率，測量苜蓿幼苗的胚芽長、胚根長、幼苗干重，計算發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，并測定幼苗的根系活力，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase activity，SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase activity，APX)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(guaiacol peroxidase activity，GPX)、過氧化氫酶(catalase activity，CAT)活性，超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生速率，羥自由基(OH·)濃度、雙氧水(H2O2)及丙二醛(malondialdehyde content，MDA)含量。

1.2　測定方法

種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率采用常規(guī)統(tǒng)計方法測定：發(fā)芽勢(%)=(4 d內正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子數(shù))×100，發(fā)芽率(%)=(10 d內正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100。胚芽長、胚根長的測定：發(fā)芽第10 天時，每處理隨機選取20株幼苗，采用精度為0.1 mm的游標卡尺分別測量胚芽長、胚根長，求平均值。幼苗干重的測定：發(fā)芽第10天時，每處理隨機選取20株幼苗，95℃殺青10 min，65℃下烘干稱重。發(fā)芽指數(shù)(GI)= ∑(Gt/Dt)，活力指數(shù)(VI)=GI×S。其中，Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，S為單株鮮重。根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法，參考鄒琦[11]的方法測定。

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250 染色法[11]測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[11]測定，游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法[11]測定，蛋白水解酶活性測定參考Zhang等[12]的方法。超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(GPX)及過氧化氫酶(CAT)活性參考André Dias de Azevedo Neto等[13]方法測定。超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生速率采用對氨基苯磺酸法[14]測定，羥自由基(OH·)濃度采用2-脫氧-D-核糖顯色法[14]測定，雙氧水(H2O2)含量采用KI顯色法[14]測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[14]測定，以上各指標重復3次。

1.3　數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，并采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(LSD法)進行多重比較。

2結果與分析

2.1　Co脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

紫花苜蓿種子在Co脅迫條件下能否正常萌發(fā)是其能否在Co污染的土壤中生長的先決條件。Co脅迫對紫花苜蓿種子的萌發(fā)有顯著的影響，并存在明顯的濃度效應，隨著Co脅迫濃度的增大，紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率(圖1)和發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)(表1)均呈降低的趨勢。由圖1可知，Co脅迫對紫花苜蓿種子發(fā)芽勢的抑制程度大于發(fā)芽率，當Co脅迫濃度達到2.5 mmol/L時，其發(fā)芽勢低于50%，發(fā)芽率也低于60%。由表1可知，0.25 mmol/L Co脅迫對紫花苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)無顯著的影響，當Co脅迫濃度達到0.5 mmol/L時，紫花苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著降低。

圖1　Co脅迫對紫花苜蓿種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Fig.1　Effect of cobalt stress on alfalfa seed germination potential and germination rate　　　不同小寫字母表示處理間差異達5%顯著水平，下同。Different letters are significantly different at P<0.05, the same below.

Co脅迫對紫花苜蓿幼苗的根系活力(表1)及生長(表2)也有明顯的影響。0.25~0.50 mmol/L Co脅迫對紫花苜蓿幼苗的根系活力無顯著影響，當Co脅迫濃度達到1.00 mmol/L時，紫花苜蓿幼苗的根系活力開始降低，并隨著Co脅迫濃度的增大而顯著降低。0.25 mmol/L Co脅迫對紫花苜蓿幼苗的胚芽長、干重無顯著的影響，但顯著降低了幼苗的胚根長，當Co脅迫濃度達到0.50 mmol/L時，紫花苜蓿幼苗的胚芽長和干重均顯著降低，并且隨著Co脅迫濃度的增大，紫花苜蓿幼苗的胚芽長、胚根長和干重呈顯著的下降趨勢。

以上結果表明，Co脅迫明顯抑制了紫花苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗的生長，致使紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)下降，顯著降低了幼苗的根系活力、胚芽長、胚根長和干重。

2.2　Co脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)中滲透調節(jié)物質含量及蛋白水解酶活性的影響

可溶性蛋白、可溶性糖是植物生長發(fā)育的主要營養(yǎng)成分，也是植物體內的重要信號分子，能夠參與植物在逆境脅迫下的信號轉導和滲透調節(jié)；游離脯氨酸也在植物滲透調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用；蛋白水解酶能夠催化貯藏蛋白的氧化分解與能量釋放，在種子萌發(fā)初期提供萌發(fā)所需要的營養(yǎng)物質和能量來源。由表3可知，當Co脅迫濃度為0.25和0.50 mmol/L時，紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中的可溶性蛋白、可溶性糖含量及蛋白水解酶活性均與CK差異不顯著；當Co脅迫濃度達到1.00 mmol/L時，紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中的蛋白水解酶活性顯著受到抑制，可溶性蛋白、可溶性糖含量顯著降低，均顯著低于CK，并且隨著Co脅迫濃度的增大而顯著下降；0.25和0.50 mmol/L Co脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中的游離脯氨酸含量顯著高于CK，其中以0.50 mmol/L Co脅迫濃度下最高，1.00 mmol/L Co脅迫對游離脯氨酸含量無顯著的影響，當Co脅迫濃度達到2.50 mmol/L時，游離脯氨酸含量顯著下降。

2.3　Co脅迫對紫花苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響

逆境條件下，植物為了避免活性氧誘導對細胞產(chǎn)生的傷害，能夠利用抗氧化酶系統(tǒng)及時清除活性氧，從而保護植物機體的生理機能。由圖2可知，隨著Co脅迫濃度的增大，紫花苜蓿幼苗葉片的SOD、APX、GPX活性均呈先升高后降低的趨勢， 而CAT活性呈下降的趨勢。當Co脅迫濃度為0.25和0.50 mmol/L時，紫花苜蓿幼苗的SOD、APX、GPX、CAT活性均與CK差異不顯著；在1.00和2.50 mmol/L Co脅迫濃度下，紫花苜蓿幼苗的SOD活性顯著高于CK，當Co脅迫濃度達到5.00 mmol/L時，SOD活性有所下降，與CK無顯著差異；在1.00 mmol/L Co脅迫濃度下，紫花苜蓿幼苗的APX、GPX活性達到最高，并且顯著高于CK，當Co脅迫濃度達到2.50 mmol/L時，APX、GPX活性開始下降，在2.50和5.00 mmol/L Co脅迫濃度下，APX、GPX活性均與CK差異不顯著；當Co脅迫濃度達到1.00 mmol/L時，隨著Co脅迫濃度的增大，紫花苜蓿幼苗的CAT活性也開始降低，并且均顯著低于CK。

表1　Co脅迫對紫花苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)

不同小寫字母表示處理間差異達5%顯著水平，下同。Different letters are significantly different atP<0.05, the same below.

表2　Co脅迫對紫花苜蓿幼苗生長的影響

表3　Co脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)中滲透調節(jié)物質含量及蛋白水解酶活性的影響

圖2　Co脅迫對紫花苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.2　Effect of cobalt stress on alfalfa seedling antioxidant enzyme activity

2.4　Co脅迫對紫花苜蓿幼苗活性氧積累及膜脂過氧化的影響

Co脅迫對紫花苜蓿幼苗體內活性氧代謝有顯著的影響(表4)。Co脅迫下，紫花苜蓿幼苗體內的O2·-產(chǎn)生速率、OH·濃度、H2O2含量及膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量均顯著增加，并且隨著Co脅迫濃度的增大而升高。在0.25 mmol/L Co脅迫濃度下，紫花苜蓿幼苗體內的O2·-產(chǎn)生速率、OH·濃度、H2O2及MDA含量均與CK差異不顯著。當Co脅迫濃度達到0.5 mmol/L時，O2·-產(chǎn)生速率、OH·濃度、H2O2及MDA含量均顯著高于CK，并隨著Co脅迫濃度的增大而顯著升高。說明Co脅迫誘導產(chǎn)生了大量的活性氧，并引起了紫花苜蓿幼苗的膜脂過氧化，而且隨著Co脅迫濃度的增大，紫花苜蓿幼苗膜脂過氧化程度進一步加劇。

表4　Co脅迫對苜蓿幼苗活性氧積累和膜脂過氧化的影響

3討論與結論

種子在逆境脅迫下能否正常萌發(fā)及幼苗生長狀況是植物能否存活的前提條件，也是某物種能否在某一地區(qū)形成自然群落的關鍵因素[15]。一般情況下，種子的發(fā)芽勢高，說明種子的生命力強，種子出苗較為整齊一致，而發(fā)芽率則能夠反映種子的出苗情況。發(fā)芽指數(shù)反映了種子的發(fā)芽速率和整齊程度，而活力指數(shù)反映了種子在較廣的范圍能否迅速發(fā)芽和生長的整齊度。本試驗中，Co脅迫顯著降低了紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)，抑制了紫花苜蓿種子的萌發(fā)。根系作為植物體最活躍的吸收器官和合成器官，其活力水平可直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。在種子萌發(fā)過程中，胚芽長、胚根長及幼苗干重也是反映幼苗生長狀況的關鍵指標。Co脅迫也顯著降低了紫花苜蓿幼苗的根系活力，降低了胚芽長、胚根長及幼苗干重，說明Co脅迫對紫花苜蓿幼苗生長有顯著的抑制作用。一般認為，重金屬對植物種子萌發(fā)及幼苗的影響存在一個較低濃度下的刺激效應和高濃度下的抑制效應。隨著Co脅迫濃度的增大，對紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制作用加劇，這與前人[16-19]的研究結果一致，但本試驗結果不存在低濃度下的刺激效應，這可能和Co的脅迫濃度有關，也可能和植物種類有關。由于種子萌發(fā)后，胚根最先突破種皮吸水，受Co脅迫的時間比胚芽長，并且胚根是種子發(fā)芽過程中吸收水分和營養(yǎng)的主要器官，Co進入幼苗體內后，大多數(shù)積累在胚根部位，所以胚根受到的抑制程度大于胚芽。

任何逆境都會引起滲透脅迫，滲透調節(jié)是植物減少逆境傷害的一個重要特征[20]。逆境脅迫下，植物體能夠通過代謝調控積累一些小分子有機物質進行滲透調節(jié)，緩解逆境造成的滲透脅迫[21]，可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸含量的高低能夠在一定程度上反映植物對逆境脅迫的耐性，而蛋白水解酶活性的升高有利于植物在逆境脅迫下積累游離氨基酸[22]。研究表明，逆境脅迫能夠誘導植物的基因表達發(fā)生改變，正常蛋白合成受阻，逆境應激蛋白被誘導合成，應激蛋白的協(xié)同作用可以清除變性蛋白、維持細胞正常代謝[23]。所以重金屬脅迫誘導可溶性蛋白含量增加，可能是植物抵抗重金屬毒害的一種解毒機制[24]。本試驗中，可溶性蛋白含量的下降可能是由于Co2+在苜蓿幼苗體內過量積累而導致細胞結構遭到破壞而引起的。同時，Co脅迫增加了苜蓿幼苗的代謝強度，進而增加了苜蓿幼苗對營養(yǎng)和能量的需求，對可溶性糖的需求和利用量增加，所以可溶性糖含量下降。Co2+在苜蓿幼苗體內的過量積累，引起蛋白質變性，也造成了可溶性蛋白含量下降，蛋白水解酶活性也受到了抑制。在低濃度Co脅迫下，游離脯氨酸含量升高以緩解Co脅迫引起的滲透脅迫，在高濃度Co脅迫下，苜蓿幼苗體內的滲透調節(jié)平衡被打破，游離脯氨酸含量下降。

在正常生理條件下，植物體內的抗氧化酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)共同發(fā)揮作用，使得體內的活性氧代謝處于動態(tài)平衡[25]。植物遭受逆境脅迫后，體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)代謝平衡會被打破，ROS大量產(chǎn)生并積累，ROS會以極強的氧化性造成細胞膜脂過氧化反應，導致膜系統(tǒng)損傷和細胞氧化，并大量積累過氧化產(chǎn)物MDA，從而引起植物的氧化傷害[26]。本試驗中，在低濃度Co脅迫(0.25和0.50 mmol/L)下，紫花苜蓿幼苗的SOD、APX、GPX、CAT活性均與CK差異不顯著，在1.00 mmol/L Co脅迫濃度下，紫花苜蓿幼苗的SOD、APX、GPX活性均顯著升高，CAT活性開始下降，之后隨著Co脅迫濃度的增大，SOD、APX、GPX、CAT活性均下降，說明Co脅迫對苜蓿幼苗抗氧化酶系統(tǒng)造成了損傷。0.25 mmol/L Co脅迫對紫花苜蓿幼苗的活性氧代謝無顯著影響，Co脅迫濃度達到0.50 mmol/L時，紫花苜蓿幼苗的活性氧代謝發(fā)生紊亂，O2·-產(chǎn)生速率、OH·濃度、H2O2及MDA含量均顯著升高，說明Co脅迫對紫花苜蓿幼苗的質膜結構造成了嚴重的傷害，這與王松華等[27]的結果一致，說明重金屬脅迫誘導膜脂過氧化是紫花苜蓿受害表現(xiàn)的普遍現(xiàn)象。

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通訊作者*Corresponding author. E-mail: shishl@gsau.edu.cn

作者簡介：張虎(1978-)，男，甘肅鎮(zhèn)原人，助教，在讀碩士。E-mail: zhangh@gsau.edu.cn

基金項目：國家現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARA-35)，全國種質資源保種(NB2130135)和農(nóng)業(yè)部行業(yè)專項“牧區(qū)優(yōu)質高效飼草生產(chǎn)利用技術研究與示范”(201003023)資助。

收稿日期：2015-03-17；改回日期：2015-04-20

DOI：10.11686/cyxb2015148http://cyxb.lzu.edu.cn