動(dòng)物RNA病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展

孫玉章，倪雪霞，李金明，吳發(fā)興，王永玲（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

?

動(dòng)物RNA病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展

孫玉章，倪雪霞，李金明，吳發(fā)興，王永玲
（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

摘 要：本文簡(jiǎn)述了反向遺傳操作技術(shù)的基本原理以及近年來動(dòng)物RNA病毒基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理、病毒與宿主間的相互作用，以及構(gòu)建新型病毒載體和研發(fā)新型疫苗等方面的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物RNA病毒；反向遺傳學(xué)；病毒拯救；新型疫苗；應(yīng)用進(jìn)展

多數(shù)動(dòng)物RNA病毒引起難以控制、危害嚴(yán)重的疫病，是病毒學(xué)領(lǐng)域重要的研究對(duì)象之一。但RNA病毒（除逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒外）的復(fù)制周期并不經(jīng)歷DNA中間階段，重組DNA技術(shù)不能直接運(yùn)用于動(dòng)物RNA病毒基因組的修飾與分析，而且RNA分子在體外較DNA分子更難以操作。近幾十年發(fā)展起來的反向遺傳學(xué)技術(shù)使這一問題得到了近乎完美地解決，極大地促進(jìn)了對(duì)動(dòng)物RNA病毒分子生物學(xué)的研究，并衍生出了“反向疫苗學(xué)”等新興學(xué)科。

反向遺傳學(xué)技術(shù)是以生物基因?yàn)橹饕芯繉?duì)象，基于對(duì)基因核苷酸序列的人為操作，探索基因調(diào)控的分子機(jī)制以及生命發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)現(xiàn)象和規(guī)律等。廣義的反向遺傳學(xué)技術(shù)是指與反向遺傳學(xué)操作相關(guān)的各種技術(shù)的統(tǒng)稱，包括定點(diǎn)突變、RNA干擾、基因沉默和基因體外轉(zhuǎn)錄等，是重組DNA技術(shù)應(yīng)用范圍的擴(kuò)展與延伸。狹義的反向遺傳學(xué)技術(shù)僅指基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中的感染性cDNA克隆技術(shù)，即早期文獻(xiàn)中通稱的“病毒拯救”技術(shù)。本文僅對(duì)這一技術(shù)在動(dòng)物RNA病毒中的原理及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)述。

1　正鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

根據(jù)病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制方式，正鏈RNA病毒可以分為兩類：第一類包括小RNA病毒科、黃病毒科等，病毒基因組僅轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種mRNA，然后翻譯為一個(gè)多聚體蛋白，由病毒本身或宿主細(xì)胞內(nèi)的酶切割為多個(gè)功能性蛋白；第二類包括披膜病毒科、杯狀病毒科、冠狀病毒科和動(dòng)脈炎病毒科等，其共有特征是通過轉(zhuǎn)錄為多個(gè)亞基因組RNAs來進(jìn)行基因表達(dá)。

正鏈RNA病毒基因組本身可以作為mRNA來利用宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)表達(dá)病毒蛋白，所以只要將其基因組RNA或其類似物導(dǎo)入合適的細(xì)胞系即可組裝出具有感染性的子代正鏈RNA病毒。因此正鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)操作相對(duì)容易獲得成功，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是感染性分子克隆的精確構(gòu)建。感染性分子克隆包括感染性cDNA克隆和感染性體外轉(zhuǎn)錄本。

構(gòu)建感染性cDNA克隆是通過反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增RNA病毒基因組的全長(zhǎng)或分段的cDNA片段，然后利用特定的限制性酶切位點(diǎn)將其克隆入合適的載體，使之受控于強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)染適當(dāng)細(xì)胞系，病毒的全長(zhǎng)cDNA克隆轉(zhuǎn)錄為mRNA并啟動(dòng)感染循環(huán)，最終獲得有感染性的子代病毒顆粒。1981年，Racaniello等通過這種方法最先得到了具有感染性的脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）。感染性體外轉(zhuǎn)錄也是先通過RT-PCR獲得病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆，在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄獲得具有感染性的基因組RNA之后，用此RNA轉(zhuǎn)染適當(dāng)細(xì)胞系以獲得感染性的病毒顆粒。2003年，Baranowski等用這種方法得到了有侵染性的口蹄疫病毒（FMDV）。

在構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆時(shí)，成功與否的另一個(gè)關(guān)鍵因素是病毒基因組的大小。一般而言，病毒基因組在15 kb以內(nèi)的比較容易拯救成功。但長(zhǎng)達(dá)28.5 kb的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）已經(jīng)可以被成功克隆，這一技術(shù)的突破預(yù)示著所有RNA病毒理論上都能夠進(jìn)行反向遺傳操作。

2　負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

負(fù)鏈RNA病毒根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)可分為兩大類：不分節(jié)段的博爾納病毒科、彈狀病毒科、副黏病毒科和絲狀病毒科；分節(jié)段的正黏病毒科、布尼亞病毒科和砂粒病毒科等。負(fù)鏈RNA病毒和正鏈RNA病毒最重要的區(qū)別就是其基因組RNA在宿主細(xì)胞體內(nèi)不能啟動(dòng)感染循環(huán)，即使其完全互補(bǔ)的正鏈基因組RNA（cRNA）也不能作為mRNA依賴宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，因此也沒有感染性。只有病毒的基因組RNA與核衣殼蛋白、磷酸化蛋白以及依賴RNA的RNA聚合酶蛋白共同形成功能性的核糖核蛋白復(fù)合體（ribonucleoprotein complex， RNP）之后才具有感染性，即RNP的形成對(duì)負(fù)鏈RNA病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是絕對(duì)必要的。負(fù)鏈RNA病毒的RNA聚合酶具有復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶的雙重功能，能夠識(shí)別其基因組內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和重啟信號(hào)。

負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作體系主要包括基因組全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的構(gòu)建及改造、輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及功能性檢定、共轉(zhuǎn)染拯救病毒和新生子代病毒有關(guān)特性的鑒定與應(yīng)用等內(nèi)容。由于除了需要構(gòu)建精確的全長(zhǎng)cDNA克隆外，還必須使之在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為基因組RNA時(shí)與核衣殼蛋白、磷酸化蛋白和RNA聚合酶蛋白共同結(jié)合形成RNP，只有這樣才有可能獲得具有感染性的子代病毒顆粒，因此負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作體系的建立與正鏈RNA病毒相比更為復(fù)雜困難，負(fù)鏈RNA病毒拯救成功的實(shí)例也較正鏈RNA病毒少的多。負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作體系的建立首先應(yīng)該歸功于Conzelmann團(tuán)隊(duì)于1994年建立的完全依賴質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的狂犬病病毒RABV拯救體系，從此打開了負(fù)鏈RNA病毒拯救的大門。2000年流感病毒IV的8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的建立標(biāo)志著以病毒拯救技術(shù)為代表的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)高峰期。

3　雙鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

雙鏈RNA病毒包含一些對(duì)人或動(dòng)物造成重大危害的病毒，如雙RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒（IBDV）和呼腸孤病毒科中的藍(lán)舌病毒（BTV）、輪狀病毒（RV）、非洲馬瘟病毒（AHSV）等。其病毒基因組結(jié)構(gòu)為互補(bǔ)雙鏈RNA，在宿主細(xì)胞質(zhì)中以非對(duì)稱全保留的方式轉(zhuǎn)錄并復(fù)制產(chǎn)生子代病毒雙鏈RNA，最終與病毒蛋白組裝并出膜，完成一個(gè)完整的生命周期。

由于雙鏈RNA病毒結(jié)構(gòu)上的特殊性，其反向遺傳學(xué)操作具有相當(dāng)?shù)碾y度，其中呼腸孤病毒更是公認(rèn)的最難建立反向遺傳學(xué)操作體系的RNA病毒之一。借助于輔助病毒感染，Roner等于1990年最早建立了正呼腸孤病毒的反向遺傳操作體系；但是直到2004年，通過這一體系的不斷完善并應(yīng)用于對(duì)基因組包裝信號(hào)區(qū)域的初步定位，才標(biāo)志著呼腸孤病毒反向遺傳操作體系的正式成熟。盡管如此，目前雙鏈RNA病毒的反向遺傳操作體系的建立策略并不統(tǒng)一：IBDV的拯救基本上是采用感染性cDNA克隆體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法，而BTV和AHSV則主要是采用構(gòu)建感染性體外轉(zhuǎn)錄本的方法。

無論是采取感染性cDNA克隆體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法還是構(gòu)建感染性體外轉(zhuǎn)錄本，動(dòng)物RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)的核心都是在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)形成病毒基因組轉(zhuǎn)錄本RNA。早期病毒拯救體系的低效很大程度上是由于無法獲得具有精確末端的病毒基因組轉(zhuǎn)錄本RNA?，F(xiàn)在的通行策略是在病毒基因組感染性cDNA分子克隆的兩端分別引入具備自剪切功能的核酶序列，一般是在病毒感染性cDNA分子克隆的5’末端引入具有3’末端剪切功能的錘頭狀核酶，在感染性cDNA分子克隆的3’末端引入具有5’末端剪切功能的丁肝核酶。另外通過密碼子優(yōu)化和調(diào)控序列的優(yōu)化都能在一定程度上提高病毒拯救的效率。病毒拯救體系的效率與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度和細(xì)胞密度均有一定關(guān)系，合適的質(zhì)粒濃度比和細(xì)胞密度都需要經(jīng)過大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)比。同時(shí)輔助轉(zhuǎn)染表達(dá)病毒其他蛋白的質(zhì)?；蛘邩?gòu)建穩(wěn)定表達(dá)輔助蛋白的細(xì)胞系都能夠在一定程度上提高拯救病毒的效率。

4　動(dòng)物RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

4.1研究病毒基因組復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理

1989年，Egelman等首先在對(duì)仙臺(tái)病毒（SeV）的研究中發(fā)現(xiàn)其病毒基因組核苷酸總數(shù)為6的倍數(shù)，隨后其他研究者在麻疹病毒（MV）及新城疫病毒（NDV）中也發(fā)現(xiàn)了這一規(guī)律，稱為“6堿基原則”。2000年，Peeters等[1]通過構(gòu)建NDV的微型基因組完美的證明了只有遵循“6堿基原則”的病毒基因組才能夠有效地轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包裝。

1999年，Peeters等[2]將NDV F基因的112位、115位和117位3個(gè)位點(diǎn)的非堿性氨基酸全部突變?yōu)閴A性氨基酸，得到了一株具有明顯強(qiáng)毒株特征的NDV毒株，證明了F基因裂解位點(diǎn)區(qū)的氨基酸序列是決定毒力的關(guān)鍵因素。而后Huang等[3]將NDV強(qiáng)毒株和弱毒珠的HN基因互換，獲救毒株的毒力均發(fā)生了變化，印證了F基因的裂解位點(diǎn)不是決定NDV毒力的唯一因素的假說。2006年，Takayama-Ito等[4]將高度致弱的RABV毒株G蛋白的第333位替換為精氨酸后毒性復(fù)強(qiáng)。2011年，Rieder等[5]發(fā)現(xiàn)RABV的P蛋白基因中鏈區(qū)176～181位氨基酸序列的缺失導(dǎo)致病毒喪失了拮抗干擾素的能力。Hoffmann等通過構(gòu)建微型基因組證實(shí)，同源或異源病毒的順式作用序列對(duì)于病毒顆粒的殼體化和轉(zhuǎn)錄具有同樣的作用，但病毒顆粒的包裝出膜則嚴(yán)格依賴于同源病毒的順式作用序列。動(dòng)物RNA病毒基因組的末端序列富含轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)，對(duì)于維持動(dòng)物RNA病毒的結(jié)構(gòu)和功能的完整性非常重要，因此無論正鏈還是負(fù)鏈RNA病毒基因組的復(fù)制和包裝，都必須具有精確的末端。Brown等[6]證實(shí)精確的3’端非編碼區(qū)對(duì)于拯救PV非常必要，非病毒末端的RNA轉(zhuǎn)染常導(dǎo)致產(chǎn)生缺失性突變體表型。國(guó)內(nèi)學(xué)者曾將以豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）北美株為骨架構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA克隆5’端非編碼區(qū)序列替換為PRRSV歐洲株的相應(yīng)序列，嵌合病毒失去了感染性。盡管目前著述眾多，然而末端調(diào)控序列對(duì)病毒拯救的確切影響尚無定論。

4.2構(gòu)建重組病毒載體和新型疫苗的研制

1996年，Bukreyev等用呼吸道合胞體病毒（RSV）表達(dá)了外源報(bào)告基因，對(duì)用獲救病毒做載體進(jìn)行了初步探索。Nakaya等[7]在NDV P和M基因之間插入了流感病毒的血凝素基因，構(gòu)建的重組病毒經(jīng)過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，其能夠抵抗致死劑量流感病毒的攻擊。Huang等[8]用重組NDV表達(dá)IBDV的VP2蛋白對(duì)NDV強(qiáng)毒株和IBDV強(qiáng)毒株的攻擊均能起到相當(dāng)良好的保護(hù)率。

基于對(duì)病毒基因組感染性cDNA克隆的改造，獲救病毒作為載體表達(dá)外源基因技術(shù)可以應(yīng)用于研制分子標(biāo)記疫苗和嵌合體疫苗。2001年，Peeters等[9]將NDV HN基因用含禽副黏病毒4型HN基因的嵌合體基因取代，救獲的嵌合體病毒不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)NDV強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)，而且根據(jù)其對(duì)HN所產(chǎn)生的抗體及血清學(xué)分析即可區(qū)別疫苗免疫與野生毒感染。

對(duì)于沒有自然弱毒株的病毒，反向遺傳學(xué)操作技術(shù)在研究新型疫苗方面展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。1997年前后，鵝源新城疫的暴發(fā)流行給我國(guó)的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其病原即為基因VII型NDV。胡順林[10]、孫玉章[11]等先后構(gòu)建了鵝源NDV野毒株的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆，在利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)獲得用于水禽新城疫防制的人工疫苗候選毒株方面進(jìn)行了有益地嘗試。作為一種高效的疫苗技術(shù)儲(chǔ)備，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)對(duì)多種動(dòng)物流感病毒和部分外來動(dòng)物疫病病原建立了反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)。

4.3研究病毒與宿主間的相互作用關(guān)系

應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)研究病毒的受體具有很大的理論和技術(shù)優(yōu)勢(shì)，其中FMDV和RABV的研究已經(jīng)建立了相對(duì)成熟的研究模型，期包含兩種基本模式：一是通過反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)病毒基因組的受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行人為突變，從而研究病毒與宿主受體間的相互作用；二是通過構(gòu)建表達(dá)宿主細(xì)胞受體的重組病毒，用于研究宿主細(xì)胞與病毒蛋白的相互作用。

Conzelamnn團(tuán)隊(duì)[12-15]應(yīng)用反向遺傳技術(shù)對(duì)RABV進(jìn)行基因重組和遺傳修飾，從而闡明了RABV在宿主神經(jīng)元內(nèi)的增殖和跨突觸傳播機(jī)理。有學(xué)者曾提出通過反向遺傳技術(shù)構(gòu)建禽-豬-人源戊肝病毒嵌合體來研究戊肝病毒的蛋白功能、組織嗜性以及跨種傳播機(jī)制等非常有意義。

通過對(duì)所構(gòu)建的病毒全長(zhǎng)cDNA感染性克隆進(jìn)行相應(yīng)功能基因的突變、缺失、插入和顛換等操作，然后利用救獲的子代病毒感染宿主細(xì)胞并檢測(cè)胞內(nèi)外免疫信號(hào)通路的變化，可以精確定位并探索病毒基因組及蛋白功能，從而可以更深入地研究病毒與宿主之間的相互修飾、相互影響的分子機(jī)制。

5　結(jié)語

作為目前國(guó)內(nèi)外眾多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái)之一，反向遺傳學(xué)操作技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，其應(yīng)用范圍不僅包括研究動(dòng)物病毒的基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理、病毒與宿主間的相互作用，還包括抗病毒策略與基因治療研究、構(gòu)建新型靶向病毒載體和進(jìn)行新型基因工程疫苗的研發(fā)，以及作為小反芻獸疫、施馬倫貝格病和非洲豬瘟等重大外來動(dòng)物疫病的基礎(chǔ)性防控技術(shù)儲(chǔ)備等。

近十幾年來，越來越多的國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室先后建立了多種動(dòng)物RNA病毒的反向遺傳操作體系，技術(shù)層面更加趨于簡(jiǎn)便高效。總體上來看，國(guó)內(nèi)的研究多集中于新型病毒載體或基因工程疫苗研究，與國(guó)外研究者更多集中于免疫信號(hào)通路等致病機(jī)理的研究熱點(diǎn)相比還有相當(dāng)差距。隨著分子生物學(xué)日新月異的發(fā)展，相信以后還會(huì)不斷有新發(fā)現(xiàn)或新改造的生物酶類或生物載體等作為強(qiáng)有力的分子工具，應(yīng)用到反向遺傳操作技術(shù)中來，從而不斷擴(kuò)大反向遺傳操作技術(shù)的應(yīng)用廣度和深度。

參考文獻(xiàn)：

[1] Peeters B P H，Gruijthuijsen Y K，De Leeuw O S. Genome replication of Newcastle disease virus： involvement of the ruleof-six[J].Arch Virol，2000，145：1829-1845.

[2] Peeters B P H，De Leeuw O S，Koch G. Rescue of Newcastle Disease Virus from cloned cDNA： evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[J]. J Virol， 1999，73（6）：5001-5009.

[3] Huang Z H，Panda A，Elankumaran S，et al. The Hemagglutinin- Neuraminidase protein of Newcastle Disease Virus determines tropism and virulence[J]. J Virol，2004，78（8）：4176-4184.

[4] Takayama-Ito M，Inoue K，Shoji Y. A highly attenuated rabies virus HEP-Flury strain reverts to virulent by single amino acid substitution to arginine at position 333 in glycoprotein[J]. Virus Res， 2006，119：208-215.

[5] Rieder M，Brzózka K，Pfaller C K，et al. Genetic dissection of interferon antagonistic functions of rabies virus phosphoprotein： inhibition of interferon regulatory factor 3 activation is important for pathogenicity[J]. J Virol，2011，85（2）：842-852.

[6] Brown D M，Cornell C T，Tran G P，et al. An authentic 3’ noncoding region is necessary for efficient Poliovirus replication[J]. J Virol，2005，79（18）：11962-11973.

[7] Nakaya T，Cros J，Park M，et al. Recombinant Newcastle Disease Virus as a Vaccine Vector[J]. J Virol，2001，75（23）：11868-11873.

[8] Huang Z H，Elankumaran S，Yunus A，et al. A recombinant Newcastle disease virus（NDV）expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus （IBDV） protect against NDV and IBDV[J]. J Virol，2004，78（18）：10054-10063.

[9] Peeters B P H，de Leeuw O S，Verstegen I，et al. Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals[J]. Vaccine，2001（19）：1616-1627.

[10] Hu S L，Ma H L，WuY T，et al. A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle disease virusgenerated by reverse genetics[J]. Vaccine，2009，27：904-910.

[11] 孫玉章，丁壯，孟柯音，等. 鵝源副黏病毒NA-1株反向遺傳操作體系的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（1）：6-9.

[12] Mebatsion T，Konig M，Conzelmann K K. Budding of rabies virus particles in the absence of the spike glycoprotein[J]. Cell，1996，84（6）：941-951.

[13] Wickersham I R，F(xiàn)inke S，Conzelmann K K，et al. Retrograde neuronal tracing with deletion-mutant rabies virus[J]. Nat Methods，2007，4（1）：47-49.

[14] Pollin R，Granzow H，K?llner B，et al. Membrane and inclusion body targeting of lyssavirus matrix proteins[J]. Cell Microbiol，2013，15（2）：200-212.

[15] 孫玉章，何彪，許運(yùn)斌，等. 狂犬病病毒單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)的建立及應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，46（11）：2020-2024.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Development and Application of the Reverse Genetics Technology for Animal RNA Viruses

Sun Yuzhang，Ni Xuexia，Li Jinming，Wu Faxing，Wang Yongling
（China Animal Health & Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：In this review，the principle of reverse genetics technology was briefl y described for animal RNA viruses. Further，the development and the recent advances of this technology were introduced in viral gene replication and regulation mechanism，viral pathogenesis mechanism，virus-hostcell interactions and novel vaccine vectors over the past decades.

Key words：animal RNA viruses；reverse genetics technology；virus rescue；novel vaccines；development and application

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）05-0068-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.022